南开大学案例二氧化碳在固定化啤酒酵母发酵过程中对挥发性芳香成分生成的影响_微生物发酵工程.doc_大学文库

C0:在四定化啤带醇母发解过程中对挥发性芳香成分生最的影响且-Y.shen.S.De Schrijver.N.Moonjai· K.J.Verstrepen.F.Delvaux.F.R.Delvaux Received:1 Septerber 2003 Revised:12 Noverber 2003 Accepted:21 Novenber 2003/Published online:16 Decerher 2003 Springer-Verlag 2003 (赵瑞脚数保) 清要：相比于传统的游离式细胞发醇系统，州定化细胞发醇系统有着更大的好处。然面。当用这些发醇罐来生产酒精饮料时，混杂香味的产生就成了一个主要的门恩。由于，对酵母的生长和代谢有抑制作用，因此一个更好的对风味成分控制的方法载是控制溶解的0的浓度。本文证明了因定的环境可以促进四从液体培养基中挥发出米，进面为发醇过程营造了一个低四的环境。此外，在固定化发醇中挥发性的高级醇和酯的产量要比传统游离式发醇高很多。往周定化发酵系统中持续通入0网(4l/1),可导致旺盛发酵时期细胞的生长违率诚少10%0八。但是发酵速率却不受影响。支链氢基酸的吸收减少了8-22%，面且高级醇和酯的成分分别减少了1跳和1既。这些研究果表明：在固定化细胞系统中不适当的芳香钢析可以通过控制固定化发醇过程中溶解四来调整。前声：固定化细胞技术已经按应用于在清精饮料（例如葡萄酒和碎酒）的发酵中以提高发醇物的产率。在固定化系统内的高细幽密度对发醇率有积极的影响。但是。固定化系统内验特的微环境己经显著地影响到了固定化细胞的生理活动。先前的研究已经迁实细胞的四定影响挥发性高级醇和面的组成。此外，酵母中程酸酯成分的活性己经技证实会受到细围因定化的积极性诱导，因为它可能与AP/PK/SCh9等营养感觉信号通路的话性有关，因此，固定化发醇的最终产品与只运用自由悬浮酵母细败的传统发醇的就能通过为香副析区分开来。在库酒前发醇过程中，许多重要的高度芳香混合物会在醇母发酵中作为次领代谢产物面产生。许多参数例如温度，溶氧、中间产物、发酵裙的设计方案和最高压力都会影响到这些芳香混合物的组成成分。在草酒酿造行业，0，对发醇性能的影响在长期以来己经得到承认。在啤酒前发酵中，溶解C0浓度的变化受到了发酵董的尺寸和几何形状，图体微较的存在，阻和温度的影响。例如，大的发解管道会导致一个大的流体静力学的压力，从而使溶解C浓度的增加，进而使高领醇和酯成分的减少。另一方面，00可以棱用米在高温或高麦芽汁浓度的发酵中控制重要的高度芳香的挥发物的组成成分。在水溶液中有很高的溶解度。它和水反应生成碳酸，疏酸部分水解成碳酸离子和质子（图1）。在 1

1 1 CO2 在固定化啤酒酵母发酵过程中对挥发性芳香成分生成的影响 H.-Y. Shen . S. De Schrijver . N. Moonjai . K. J. Verstrepen . F. Delvaux . F. R. Delvaux Received: 1 September 2003 / Revised: 12 November 2003 / Accepted: 21 November 2003 / Published online: 16 December 2003 Springer-Verlag 2003 （赵瑞卿翻译）摘要：相比于传统的游离式细胞发酵系统，固定化细胞发酵系统有着更大的好处。然而，当用这些发酵罐来生产酒精饮料时，混杂香味的产生就成了一个主要的问题。由于 CO2 对酵母的生长和代谢有抑制作用，因此一个更好的对风味成分控制的方法就是控制溶解的 CO2 的浓度。本文证明了固定的环境可以促进 CO2 从液体培养基中挥发出来，进而为发酵过程营造了一个低 CO2 的环境。此外，在固定化发酵中挥发性的高级醇和酯的产量要比传统游离式发酵高很多。往固定化发酵系统中持续通入 CO2（45ml/min），可导致旺盛发酵时期细胞的生长速率减少 10%-30%，但是发酵速率却不受影响。支链氨基酸的吸收减少了 8-22%，而且高级醇和酯的成分分别减少了 15%和 18%。这些研究结果表明：在固定化细胞系统中不适当的芳香剖析可以通过控制固定化发酵过程中溶解 CO2 来调整。前言：固定化细胞技术已经被应用于在酒精饮料（例如葡萄酒和啤酒）的发酵中以提高发酵物的产率。在固定化系统内的高细胞密度对发酵率有积极的影响，但是，固定化系统内独特的微环境已经显著地影响到了固定化细胞的生理活动。先前的研究已经证实细胞的固定影响挥发性高级醇和酯的组成。此外，酵母中醋酸酯成分的活性已经被证实会受到细胞固定化的积极性诱导，因为它可能与cAMP/PKA/Sch9等营养感觉信号通路的活性有关。因此，固定化发酵的最终产品与只运用自由悬浮酵母细胞的传统发酵的就能通过芳香剖析区分开来。在啤酒前发酵过程中，许多重要的高度芳香混合物会在酵母发酵中作为次级代谢产物而产生。许多参数例如温度、溶氧、中间产物、发酵罐的设计方案和最高压力都会影响到这些芳香混合物的组成成分。在啤酒酿造行业，CO2对发酵性能的影响在长期以来已经得到承认。在啤酒前发酵中，溶解CO2浓度的变化受到了发酵罐的尺寸和几何形状，固体微粒的存在，PH和温度的影响。例如，大的发酵管道会导致一个大的流体静力学的压力，从而使溶解CO2浓度的增加，进而使高级醇和酯成分的减少。另一方面，CO2可以被用来在高温或高麦芽汁浓度的发酵中控制重要的高度芳香的挥发物的组成成分。 CO2在水溶液中有很高的溶解度。它和水反应生成碳酸，碳酸部分水解成碳酸离子和质子（图 1）。在

2 一个低缓冲能力的基质中，这生反应会造成明显的州下降，州下降进一步的影响到了细胞代谢。更重要的是，C0,可以白由的渗入血浆额中，溶解到细围质中，释故重碳酸盐离子和质子。为了维特体内的H,质子会通过与TP联合的主动运输逢径转移到外面的基质中，而AP是直接为生物合成、生长和其他的细题活动提供能量的。此外，据研究四能政变膜的特性，从而对溶质的运输产生负面的影响。同时能和氨基酸及蛋白质的肽单位反应。从而最终导政蛋白结构和话性的变化，面且，据报道，四对酶的活性有特定的影响，尤其是与段化反应，去碳反应有关的酶。本项研究旨在阐明0在固定化酵母发酵过程中对高度芳香组成成分的影响。首先，在发酵过程中，固定化细胞系统中溶解的0量的变化会被监视以拿来和游离化细胞系统中的相比较。然后将2通入到一个含有图定化醇母细鞋發气生物反应器中来现察C2对固定化酵母细胞代谢活动的影响。G2对固定化细胞系统中细胞数目、氨基酸的吸收和高级醇和酯的组成成分的影响在这项研究中得到了充分的浮告。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1商种本文所用醇母是从麦芽酿酒科学文化收藏中心得来的酸迹几S.151的商业啤酒酵母。原种培养是在-70°C下加入了20%甘油(/y)的麦芽汁培养基上进行的。 1.1.2培养基和生长条件本培养基包含80z/1的箱登糖，272g/1HF0,2.6/1NH》,S04g/1的解母抽提物((LBL, ancashire,K),L.5g/1的柠檬酸(Siga,Steinheim,Gernany),6g/1的柠檬酸钠，0.5g/1S0N·720, 0.5/1C12·2H2040g/1的吐温-80和042/1ZmC1,培养基的碳源和氨源121”C高压下天菌1an。培养基的最终为50土0.l,用柠檬酸和柠檬酸钠作为其缓冲液。将在Eppendorf管中的1nl原种培养物接种到251的基质中，然后在20°C下150Ta振荡培养48贴。将上述培养基转到2501的新鲜培养基中在相同的条件下培育贴，在整个发酵试验过程中用的是相同的培养基。 1.2实数方法 1.21在圆柱形瓶子里里分别用游离的和因定化的细胞进行实验室规模的发醇实验室规模的发醇实验在00加1的圆柱形瓶子里进行以测定发酵过程中C0溶解量的变化，取对数生长期的酚母细整(10ce11s/l)接种到充满00的培养基(00如l,溶氧量8/1)中，培养基有成没有固定化枫板。济氧量用一种济氧量校正仪器(m0xi340-VSET,ei1hein,Geny)测量.整个发醇过程维持在2O”C在发醇过程中用一个气塞米阻止外部的空气进入内部。固定化的慎板是用一种多孔不锈钢光纤做成的，星圆形，直径0，长30m在围定化细胞系统中，周片模板垂直放置以使细胞自由结合。如 2

2 2 一个低缓冲能力的基质中，这些反应会造成明显的PH下降，PH下降进一步的影响到了细胞代谢。更重要的是，CO2可以自由的渗入血浆膜中，溶解到细胞质中，释放重碳酸盐离子和质子。为了维持体内的PH，质子会通过与ATP联合的主动运输途径转移到外面的基质中，而ATP是直接为生物合成、生长和其他的细胞活动提供能量的。此外，据研究CO2能改变膜的特性，从而对溶质的运输产生负面的影响。同时CO2能和氨基酸及蛋白质的肽单位反应，从而最终导致蛋白结构和活性的变化。而且，据报道，CO2对酶的活性有特定的影响，尤其是与羧化反应、去碳反应有关的酶。本项研究旨在阐明CO2在固定化酵母发酵过程中对高度芳香组成成分的影响。首先，在发酵过程中，固定化细胞系统中溶解的CO2量的变化会被监视以拿来和游离化细胞系统中的相比较。然后将CO2通入到一个含有固定化酵母细胞鼓气生物反应器中来观察CO2对固定化酵母细胞代谢活动的影响。CO2对固定化细胞系统中细胞数目、氨基酸的吸收和高级醇和酯的组成成分的影响在这项研究中得到了充分的评估。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌种本文所用酵母是从麦芽酿酒科学文化收藏中心得来的酿造KUL.CMBS.151的商业啤酒酵母。原种培养是在-70°C下加入了20%甘油（w/v）的麦芽汁培养基上进行的。 1.1.2 培养基和生长条件本培养基包含80g/l的葡萄糖，2.72g/l KH2PO4, 2.6 g/l (NH4)2SO4,4g/l的酵母抽提物（(LAB M, Lancashire, UK），1.5g/l的柠檬酸（Sigma, Steinheim, Germany）,6g/l的柠檬酸钠，0.5 g/l MgSO4·7H2O, 0.5 g/l CaCl2·2H2O,40mg/l的吐温-80和0.42 mg/l ZnCl2,培养基的碳源和氮源121°C高压下灭菌15min。培养基的最终pH为5.0±0.1，用柠檬酸和柠檬酸钠作为其缓冲液。将在Eppendorf管中的1 ml原种培养物接种到25ml的基质中，然后在20°C下150rpm振荡培养48h。将上述培养基转到250ml的新鲜培养基中在相同的条件下培育48h。在整个发酵试验过程中用的是相同的培养基。 1.2 实验方法 1.2.1 在圆柱形瓶子里里分别用游离的和固定化的细胞进行实验室规模的发酵实验室规模的发酵实验在500ml的圆柱形瓶子里进行以测定发酵过程中CO2溶解量的变化。取对数生长期的酵母细胞（107 cells/ml）接种到充满CO2的培养基（400ml，溶氧量8mg/ml）中,培养基有或没有固定化模板。溶氧量用一种溶氧量校正仪器（(WTW Oxi 340-A/SET, Weilheim, Germany）测量。整个发酵过程维持在20°C.在发酵过程中用一个气塞来阻止外部的空气进入内部。固定化的模板是用一种多孔不锈钢光纤做成的，呈圆形,直径30mm，长30mm.在固定化细胞系统中，四片模板垂直放置以使细胞自由结合。加

入模板后，总体积的增如量少于跳。 (刘博远醒译) 1.2.2在半体机圈锥形鼓气生物反应器中用国定化细胞进行的发醇为了进行上面的发酵实验构建了一个圆维形鼓气生物反应器（长0，内径144m)并且带了一个同心导流管（长350m,内径98am)。有效的反应体积是7800a1。四定模板（长140，直径30m)放在导通管里面.另外，又制造了几个小的模板（长30■，直径30▣），从面可以使用镊子从生物反应器的项端进行多次取样，这些模板整直放在导流管内，占用了不到5降的有效反应体积，接种之后(12000000e011s/a1), 酵母细胞在含有固定模板的生物反应器中15°C下培有帅以获得白由粘连在模板表面的细围。在用清毒福物水冲洗掉剩余的培养基和悬浮的细胞后。用新鲜的培养基（容氧量8g/:1)更新发酵培养基。挂在国定核板上的原始细图在657.5*10c011s/a1. 为了研究00对图定化细围发酵的影响，在果面的导流管下面5处放置了一个多孔渗水的微型铝锅艺 (长20，直径9cn孔径100-160μ■)以通入C0.C①的流动速率通过一个流速校准仪保持在45al/min,发酵在15”C下进行，取样间隔为24h。 C02+HO◆H,CO3·HCO1+H CO:+H2O H.CO3 HCO3+H* 图1C心在发醇培养基中可以与水化合进面水解生成重碳酸盐和质子。另外，C0也可以自由浅入酵母的质膜中与细胞内的水反应生成重碳酸盐和质子，这些反应是可道的，即使由于细胞内更高的，会导致细围内的离解反应更优先。 1.3分析方法 1.3.1C0溶解量的测定 C的溶解量用Zahs新型大气碳酸计(Series5000,2ahn&Nagel,Holland,发Y.)测定。小心地将爱解培养基(300加)转移到一个标准的啤酒瓶中，然后立即封上盖。刷烈振荡过后，用空气检漏计测量框子项端的压力，同时记录培养基的温度，根据一个标准的温度与压力换算表，将压力换算成浓度（小1

3 3 入模板后，总体积的增加量少于5%。（刘博远翻译） 1.2.2 在半体积圆锥形鼓气生物反应器中用固定化细胞进行的发酵为了进行上面的发酵实验构建了一个圆锥形鼓气生物反应器（长650mm，内径144mm）并且带了一个同心导流管（长350mm，内径98mm）。有效的反应体积是7800ml。固定模板（长140mm，直径30mm）放在导流管里面.另外，又制造了几个小的模板（长30mm，直径30mm），从而可以使用镊子从生物反应器的顶端进行多次取样。这些模板竖直放在导流管内，占用了不到5%的有效反应体积。接种之后（12 000 000cells/ml），酵母细胞在含有固定模板的生物反应器中15°C下培育20h以获得自由粘连在模板表面的细胞。在用消毒蒸馏水冲洗掉剩余的培养基和悬浮的细胞后, 用新鲜的培养基（容氧量8mg/ml）更新发酵培养基。挂在固定模板上的原始细胞在6.5~7.5 *106 cells/ml. 为了研究CO2对固定化细胞发酵的影响,在里面的导流管下面5cm处放置了一个多孔渗水的微型铝锅芯（长20cm，直径9cm孔径100-160μm）以通入CO2。CO2的流动速率通过一个流速校准仪保持在45ml/min。发酵在15°C下进行，取样间隔为24h。图1 CO2在发酵培养基中可以与水化合进而水解生成重碳酸盐和质子。另外，CO2也可以自由渗入酵母的质膜中与细胞内的水反应生成重碳酸盐和质子。这些反应是可逆的，即使由于细胞内更高的pH,会导致细胞内的离解反应更优先。 1.3 分析方法 1.3.1 CO2溶解量的测定 CO2的溶解量用Zahm 新型大气碳酸计（Series 5000, Zahm & Nagel, Holland, N.Y.）测定。小心地将发酵培养基（300ml）转移到一个标准的啤酒瓶中，然后立即封上盖。剧烈振荡过后，用空气检漏计测量瓶子顶端的压力，同时记录培养基的温度。根据一个标准的温度与压力换算表，将压力换算成浓度（g/l）

1.3,2发酵培养基的检测每隔一段倒定的时间，取发酵培养基在4”C1400g下离心，除去醇母细胞。培养基密度果用P Paar 5A8和声波顿率分析器（格拉茨，奥地利测量。为分析高度芳香混合物（高级醇，常），取51培养基用带有装备有Chrompack-4nx52B毛细管柱（长50：直径032国：层厚度1.2μ黑，Yarian,Middelburg, 荷兰)的氢火焰化离子检测置FID)(Perkin-Elmer项空进杆器HS0白动弱统XL,oak,美国康程我格州.)的气相色语仪进行气相色进分析。进样前样品60°C预热16分钟。注射器和FID分别隆持在180°C和 250°C,用氯气作载气，结果用Perkin-Elmer Turbochron Navigator软件(Perkim-EIeT,Norwalk,美国康涅致格州)进行分析。培养基的氨基酸分析像前人描述的一样用dabsy1 ation方法分析(Shen等人。2003a)。发酵培养基用超滤插入物超滤蛋白质UFC,超滤蛋白质r5,000:Mi11 ipore,Bedford,ass.)并用dabsyl氯化物(l24 W丙阻，S1ma)行生，用自动前置柱dabsylat1on装置(AS3500,Ther-Finnizan,San Jose,Calif.》。用乙睛/醒酸作为流动相，衍生的氨基酸在C18桂（长，150m:直径，4.6m;粒度，5=画，A11tch, Deerfie1d,I11.)上被分离。包括一个预处理小柱（长30■；直径4.6m)用.繁外探测器3000服 ThermoFinnigan),在365nm下进行检测，结果用PC1000 System软件进行分析(Wer.35,ThernoFinnigan)。 1.3.3饵胞中脂斯酸分析霜防酸分析按照有一些改动后的Chen(1981)的方法分析完成。将一团解的醇母细胞（提重100ag) 瑟浮在101(1：1v/)氢氧化钾(10和甲醇的混合物中。添加十七烷酸(C17:0,1,0l,0.25g/l甲醇溶液，S1》作为内部标准。混合物煮沸30分钟完成皂化过程。在1■1氯化氢酸化后，混合中的丽斯酸鼓3正己烷离心萃取。重复提取过程，混合的有机相在氨气里干燥浓缩。脂防酸甲酯由其在15C株箱箱中与1三氯化哪甲醇溶液(1钱Sg)反应10分钟后行成。所防酸甲酯用甲苯萃取并准答好有机相用以气相色游仪分析。样品使用装备了FID的Var1an3300气相色谱仪分析，毛细管柱(AT-225,长30：直径032m:膜厚度， 0,25■■，A111c》用于分离需斯酸甲酯，用氢气作为载气。棋箱温度设置100°C作为初始温度，然后以 10°C/ain逐渐增如到200°C。温度维特在200°C6分钟.注射器和检测器温度分别维持在250°C和230° C。结果用Chroa-Cards软件分析(Varian,almut Creek,Calif.), 刻度线的确定采用脂防酸甲酯的标准(A111h)。面防酸组成由样品比例的峰面积计算对比国内标准 C17:0. 1.3,4细胞数量的测定

4 4 1.3.2 发酵培养基的检测每隔一段固定的时间，取发酵培养基在4°C1400g下离心，除去酵母细胞。培养基密度采用AP Paar DSA48和声波频率分析器(格拉茨，奥地利)测量。为分析高度芳香混合物（高级醇，脂），取5ml培养基用带有装备有Chrompack-Wax 52 CB毛细管柱（长50 m; 直径0.32 mm;层厚度 1.2 μm, Varian , Middelburg, 荷兰)的氢火焰化离子检测器 (FID) (Perkin-Elmer顶空进样器HS40 自动系统XL, Norwalk,美国康涅狄格州.)的气相色谱仪进行气相色谱分析。进样前样品60°C预热16分钟。注射器和FID分别维持在180°C和 250°C。用氦气作载气。结果用Perkin-Elmer Turbochrom Navigator软件(Perkin-Elmer,Norwalk, 美国康涅狄格州)进行分析。培养基的氨基酸分析像前人描述的一样用dabsylation方法分析 (Shen等人. 2003a)。发酵培养基用超滤插入物超滤蛋白质(UFC，超滤蛋白质Mr=5,000; Millipore, Bedford, Mass.) 并用dabsyl氯化物(12.4 mM 丙酮, Sigma)衍生，用自动前置柱dabsylation装置(AS3500, Thermo-Finnigan, San Jose, Calif.)。用乙腈/醋酸作为流动相，衍生的氨基酸在C18柱(长,150 mm; 直径, 4.6 mm;粒度, 5 μm, Alltech, Deerfield, Ill.)上被分离。包括一个预处理小柱(长30 mm; 直径 4.6 mm)用,紫外探测器(UV3000HR, ThermoFinnigan).在365nm下进行检测。结果用PC1000 System 软件进行分析(Ver. 3.5, ThermoFinnigan)。 1.3.3 细胞中脂肪酸分析脂肪酸分析按照有一些改动后的Chen (1981)的方法分析完成。将一团解冻的酵母细胞（湿重100mg）悬浮在10ml (1:1 v/v)氢氧化钾(1 N)和甲醇的混合物中。添加十七烷酸(C17:0, 1.0 ml, 0.25 mg/ml甲醇溶液, Sigma)作为内部标准。混合物煮沸30分钟完成皂化过程。在1ml氯化氢酸化后，混合中的脂肪酸被3ml正己烷离心萃取。重复提取过程，混合的有机相在氮气里干燥浓缩。脂肪酸甲酯由其在105°C烘箱箱中与1ml三氟化硼甲醇溶液(14%, Sigma)反应10分钟后行成。脂肪酸甲酯用甲苯萃取并准备好有机相用以气相色谱仪分析。样品使用装备了FID的Varian 3300气相色谱仪分析。毛细管柱(AT-225,长 30 m;直径0.32 mm;膜厚度, 0.25 μm, Alltech)用于分离脂肪酸甲酯，用氦气作为载气。烘箱温度设置100°C作为初始温度，然后以 10°C/min逐渐增加到200°C。温度维持在200°C 6 分钟。注射器和检测器温度分别维持在250°C和230° C。结果用Chrom-Card软件分析(Varian, Walnut Creek, Calif.)。刻度线的确定采用脂肪酸甲酯的标准(Alltech)。脂肪酸组成由样品比例的峰面积计算对比国内标准 (C17:0)。 1.3.4 细胞数量的测定

5 自由悬浮的细雅数量由血红细胞计数器计量，将图定的细胞榄板上的细胞放在Q9纳等渗氯化钠溶液中在摇味上4°C350阳速行0分钟培养后释放。细散模板香要用冷却的蒸喻水以慢速祸流洗涤多次直至洗液的00一小于0,01。释放的细数的是浮液经1400g离心和蒸帽水洗涤后称量湿重。游离细敢的核版由0,3酒氧氧化钠溶液清洗，然后满馏水洗涤多次以清除底物沉淀。随后烘箱105”C过夜干燥。称重细胞按国干重毫克每克模板计量，从而转化成细胞数量。由此得到一个细胞干重与细胞数量的经验公式，细胞数量（百万细1)=15,2×细雅干重(/m1),-0,97。另一个经验公式是细融干重与细胞混重的关系。细胞干重(）=0.17×细胞混重(g),r0.83。 (额书阁题译) 2结果 2.1游离的与园定化细胞发醇过程中济解02的变化为研究细胞固定对于发酵速率和发醇过程中C2溶解量的影响在Schott锥形瓶中进行了静态发酵实验。如图2所示，用图定榄板进行的发酵过程中底物的利用水平提高了，这可以鼓发醇时培养基沫度的变化曲线所迁明。北外，在整个发酵过程中，因定化细胞系统中溶解的水平比游离细数系统的要低。比如，经过28小时发酵之后，固定化细胞系统中溶解C①，的浓度贝有游南细胞系统的30.解母南发酵过程中，1 克葡萄精大约被转化成0.5克乙醇和0.5克0四。在北基础之上，经过28小时发解之后，根据糖消耗的总量 (19,8克提供给固定化细图系统，129克提供给游离细散系统)，固定化细胞系统产生的以古到了2算，面瓣离细胞系统中贝有1.6%。此外，发解过程中可以在四定化细胞模板周围发现更多的00，气泡结品现象。这说明。固定细围体系中产生的00技更高效地从液相移除，导致了溶解00，的浓度低下。 10 98 8 04 8 08 6 04 02 3 0 2030 40 Tme (hours) 图2实验室条件下培养基提取物浓度（实线》和相对溶解的①水平《虚线）在游离细胞（口）和因定化细胞（口）系统中发酵时的变化 5

5 5 自由悬浮的细胞数量由血红细胞计数器计量。将固定的细胞模板上的细胞放在0.9%等渗氯化钠溶液中在摇床上4°C 350rpm进行20分钟培养后释放。细胞模板需要用冷却的蒸馏水以慢速涡流洗涤多次直至洗液的OD600nm小于0.01。释放的细胞的悬浮液经1400g离心和蒸馏水洗涤后称量湿重。游离细胞的模板由0.3% 氢氧化钠溶液清洗，然后蒸馏水洗涤多次以清除底物沉淀，随后烘箱105°C过夜干燥。称重细胞按照干重毫克每克模板计量，从而转化成细胞数量。由此得到一个细胞干重与细胞数量的经验公式。细胞数量 (百万细胞/ml) =15.2 × 细胞干重 (mg/ml), r 2 =0.97。另一个经验公式是细胞干重与细胞湿重的关系。细胞干重(mg) =0.17 × 细胞湿重 (mg), r 2 =0.89。（颜书阁翻译） 2 结果 2.1 游离的与固定化细胞发酵过程中溶解CO2的变化为研究细胞固定对于发酵速率和发酵过程中CO2溶解量的影响在Schott锥形瓶中进行了静态发酵实验。如图2所示，用固定模板进行的发酵过程中底物的利用水平提高了，这可以被发酵时培养基浓度的变化曲线所证明。此外，在整个发酵过程中，固定化细胞系统中溶解CO2的水平比游离细胞系统的要低。比如，经过28小时发酵之后，固定化细胞系统中溶解CO2的浓度只有游离细胞系统的50%。酵母菌发酵过程中，1 克葡萄糖大约被转化成0.5克乙醇和0.5克CO2。在此基础之上，经过28小时发酵之后，根据蔗糖消耗的总量（19.8克提供给固定化细胞系统，12.9克提供给游离细胞系统），固定化细胞系统产生的CO2占到了2.4%，而游离细胞系统中只有1.6%。此外，发酵过程中可以在固定化细胞模板周围发现更多的CO2气泡结晶现象。这说明，固定细胞体系中产生的CO2被更高效地从液相移除，导致了溶解CO2的浓度低下。图 2实验室条件下培养基提取物浓度（实线）和相对溶解的CO2水平（虚线）在游离细胞（ ○ ）和固定化细胞（ □ ）系统中发酵时的变化

所防酸百分比) 棕榈酸C16:0阁) 34.1±0.2 40.0±0.4 33.0±0.1 37.8±0.3 棕阁油隐C16:1) 34.2±0.5 29.9±0.2 321±0.1 309±02 硬脂酸C18:0) 7.5±0.1 R.3±0.2 85±0.2 89±0.4 油酸C18:】) 24.3±0.3 21.8±0.5 26.5±0.2 225±0.1 不饱和/饱和稀斯酸比例 1.41 1.07 1.41 1.14 表】在发酵结来时(0%发酵进程)在固定化细胞系统中没有00通入和有00通入是游离细胞和固定细胞细胞中脂防酸的成分，结果是平均值土标准误团2中显示了发酵曲线。固定化细围系统中是否通入00并没有使发酵速率产生较大区别（图3》。但是在两种情况下，细胞数量却有较大不月.（图3部-C)通入00的系统对于游离细胞和因定细胞的生长都有负面影响，在起初三天的发酵过程中。有)通入的情况下。静离细型的数量平均下降八，因定细胞的数量平均下降10%。 )也被认为与细型原的磷霜有关，它会影响到细雅陕的流动性和通透性的等原的主要性质。然而，在我门的实险中并没有发现0对于游离饵胞域者国定饵胞脂膨酸的形成造成最著影响，然而，游离细胞和固定细数中不饱和脂防酸和饱和脂防酸的比例却有所不同。因定细围中较低含量的不饱和脂防酸证实了我们先前的实验结果，纸胞的固定影响细胞膜脂防酸的形成。 2.3发酵中00对挥发性高级醇类和曜类生成的影响挥发性混合物的组成决定了消精饮料的香味。据报道，在发酵中挥发性高饭醇类和脂类的组成受到细胞固定化的影响。北研究中，经过6个小时的发解后，发酵产物中的挥发性高级醇类和脂类用气相色诗分析仪进行分析。在平均水平上，固定化细散发厨系统比游离细胞发醇系统产生更多的高级醇类和雷类（表 2),与我门先前的发现一数。在因定化细胞发酵系统中发酵产生的乙酸异丁酯和乙酸异发酯分别是在解离饵胞发酵系统中产生的3倍和B倍。这也许是在固定化细胞发醇系统中能够相对快速发酵的的结果《图 2)。醇母新陈代谢时产生的)的有效去除可能也和挥发性醇类和脂类生成的提高有关。在游离的和固定化细胞发酵系统中，乙酸异戊酯和乙酸异戊醇的比例显示，醇的形成可能与细胞固定化的诱导有关。以前的研究显示，在无清精啤清发醇中固定化的细胞能够提高控制酯类形成的乙能基转移酶的活性。更进一步证明，在因定化的细胞中修够编码乙酰基转移解的TF1基因能够更充分的表达。 (陈样东保) 高级醇类和脂类的形成受到0压力的影响。在因定化细敢发酵中0对挥发物的生成的影响得到了更详细的研究。在发酵过程中。监控懒氨酸和亮氯酸的利用情况。两种氨基酸鼓利用分别生成乙酸异丁醇 7

7 7 脂肪酸百分比(%) 棕榈酸C16:0 (%) 棕榈油酸C16:1 (%) 硬脂酸C18:0 (%) 油酸C18:1 (%) 不饱和/饱和脂肪酸比例 34.1±0.2 40.0±0.4 34.2±0.5 29.9±0.2 7.5±0.1 8.3±0.2 24.3±0.3 21.8±0.5 1.41 1.07 33.0±0.1 37.8±0.3 32.1±0.1 30.9±0.2 8.5±0.2 8.9±0.4 26.5±0.2 22.5±0.1 1.41 1.14 表1 在发酵结束时（ 80 ％发酵进程）在固定化细胞系统中没有CO2 通入和有CO2 通入是游离细胞和固定细胞细胞中脂肪酸的成分。结果是平均值±标准误图2中显示了发酵曲线。固定化细胞系统中是否通入CO2 并没有使发酵速率产生较大区别(图 3A)。但是在两种情况下，细胞数量却有较大不同。(图 3B–C)通入CO2的系统对于游离细胞和固定细胞的生长都有负面影响。在起初三天的发酵过程中，有CO2 通入的情况下，游离细胞的数量平均下降30%，固定细胞的数量平均下降10%。 CO2也被认为与细胞膜的磷脂有关，它会影响到细胞膜的流动性和通透性的等膜的主要性质。然而，在我们的实验中并没有发现CO2对于游离细胞或者固定细胞脂肪酸的形成造成显著影响。然而，游离细胞和固定细胞中不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的比例却有所不同。固定细胞中较低含量的不饱和脂肪酸证实了我们先前的实验结果，细胞的固定影响细胞膜脂肪酸的形成。 2.3 发酵中CO2 对挥发性高级醇类和脂类生成的影响挥发性混合物的组成决定了酒精饮料的香味。据报道，在发酵中挥发性高级醇类和脂类的组成受到细胞固定化的影响。此研究中，经过96个小时的发酵后，发酵产物中的挥发性高级醇类和脂类用气相色谱分析仪进行分析。在平均水平上，固定化细胞发酵系统比游离细胞发酵系统产生更多的高级醇类和脂类（表 2），与我们先前的发现一致。在固定化细胞发酵系统中发酵产生的乙酸异丁酯和乙酸异戊酯分别是在游离细胞发酵系统中产生的3倍和6倍。这也许是在固定化细胞发酵系统中能够相对快速发酵的的结果（图 2）。酵母新陈代谢时产生的CO2 的有效去除可能也和挥发性醇类和脂类生成的提高有关。在游离的和固定化细胞发酵系统中，乙酸异戊酯和乙酸异戊醇的比例显示，醇的形成可能与细胞固定化的诱导有关。以前的研究显示，在无酒精啤酒发酵中固定化的细胞能够提高控制酯类形成的乙酰基转移酶的活性。更进一步证明，在固定化的细胞中能够编码乙酰基转移酶的ATF1基因能够更充分的表达。（陈祥东翻译）高级醇类和脂类的形成受到CO2 压力的影响。在固定化细胞发酵中CO2 对挥发物的生成的影响得到了更详细的研究。在发酵过程中，监控缬氨酸和亮氨酸的利用情况。两种氨基酸被利用分别生成乙酸异丁醇

10 图4发解过程中国定化细胞系统中不通入（口）D和通入（心》）时支链氨基酸的变化与高级醇和面的形成曲线。A,B支链氨基酸的变化：A领氨酸，B亮氨酸。C-E高领醇类的形成：C丙醇，D异丁醇， E异2醇。下日高饭带类的形成：F己酸乙酯，G乙酸乙酯，H乙酸异度酯。具有芳香味的高级醇和酯与醇母细胞的生长和培养基的利用具有密切的相关性，这个研究的结果证明在固定化细粒中溶解的0可能对高级醇和酯的形成产生影响。高级醇能够作为次级产物在支佳氨基酸的分解和合成途径中形成。在分解途径中，也叫Ehrlich途径，第一步是一个转氨反应，生成一个@一酮酸。这些例酸在随后的反应中脱去羧基形成；，然后进一步形成各自的高领醇。在外源氨基酸足够时，分解途径是主要的。当外源氨基酸耗尽时或有分解代谢神制物出观时，高领醇就会通过合成途径生成。从碳源中衍生的一酮酸能够转化为相应的醇。高级醇的浓度决定于相应的氨基酸和糖类的利用效率。这也许能够解释为什么某些高领醇（如内醇，异戊醇）形成时与相应的氨基酸（分别是苏氨酸和亮氨酸）梭利用时相比)的作用更显著。氨基酸的利用直接暖间接的和产物的数量有关。因此，在溶解的C0作用下高级醇的生成的减少可能与降低了的细胞生长水平有美，这在此项研究中也观测到了（图3B-C)。而且。氨基酿利用的改变能够直接导政高级醇形成的减少，此外，去碳酸基反应对制酸生成高领醇可能也是必要的，这个反应受到溶解的0m影响。另外一组具有芳香味的挥发性臀酸酯是由乙酰基转移酶催化相应的醇和辅酶人之间的缩合反应形成的。由于抑制细胞的生长或直接对去碳酸基反应的直接影响，溶解的心可使减少了培养基的有效成分，即高级醇和辅解A,从而减少了酯形成，Lau等人研究表明，在0四压力下，酯的形成与相应的高级醇的单位体积的量的相关性比与其有效性的相关性更强。木研究中，细胞的生长和高领醇的形成都受到溶解的0的牵制。两者联合的影响包许是造成在通入0的固定化细鞋发酵系统中的较低的酯生成原因。除了溶解的0，可能对挥发物的形成造成新陈代谢方面的影响外，通入的0，也可能在用气体剥离的方法是去除了部分挥发性物质。为了研究气体剥离影响的程度，在固定化细胞发酵系统中通以等量氨气《数据没有显示)。在与同样的未通如氨气的系统比较时，酯的形成诚少但高级醇的形成增加。在麦芽汁培养基中，军发物的去除程度是有亨利定律常数决定的。同样的，在气体刹离时留比高级醇更易从麦芽汁培养基中去除。通以氯气时酯的减少量显示，在通以0的网定化细胞发酵系统中，气体剥离的影响也是迹成挥发性混合物减少的原因。在通以氨气时高领醇的增加显示在通气反应器中气体测离可能增加了大量的传递物从而迹成代谢话动的提高。总之，固定化模板的出现不仅为细胞提供了用着物，面且是①气泡形成的成核位点，因此，使四更容易去豫。反过米说，这对酵母细胞的生理活动和重要的次缓具有芳香账的次级产物的形成产生了深刺影响。在固定化细围系统中解母细散生理的改变也许是物制作用的结果，加之由于细围或表面的接触和大量的传递物的限制使细围发生改变。在固定化细围中发醇终产物中混杂香味产物的组成变化与在游离细 10

10 10 图4 发酵过程中固定化细胞系统中不通入(□) CO2 和通入(Δ) CO2 时支链氨基酸的变化与高级醇和酯的形成曲线。A,B 支链氨基酸的变化：A 缬氨酸，B 亮氨酸。C-E 高级醇类的形成：C 丙醇，D 异丁醇， E 异戊醇。F-H 高级脂类的形成：F 己酸乙酯，G 乙酸乙酯，H 乙酸异戊酯。具有芳香味的高级醇和酯与酵母细胞的生长和培养基的利用具有密切的相关性。这个研究的结果证明在固定化细胞中溶解的CO2 可能对高级醇和酯的形成产生影响。高级醇能够作为次级产物在支链氨基酸的分解和合成途径中形成。在分解途径中，也叫Ehrlich途径，第一步是一个转氨反应，生成一个α- 酮酸。这些酮酸在随后的反应中脱去羧基形成醛，然后进一步形成各自的高级醇。在外源氨基酸足够时，分解途径是主要的。当外源氨基酸耗尽时或有分解代谢抑制物出现时，高级醇就会通过合成途径生成。从碳源中衍生的α- 酮酸能够转化为相应的醇。高级醇的浓度决定于相应的氨基酸和糖类的利用效率。这也许能够解释为什么某些高级醇（如丙醇，异戊醇）形成时与相应的氨基酸（分别是苏氨酸和亮氨酸）被利用时相比CO2 的作用更显著。氨基酸的利用直接或间接的和产物的数量有关。因此，在溶解的CO2 作用下高级醇的生成的减少可能与降低了的细胞生长水平有关，这在此项研究中也观测到了（图3B-C）。而且，氨基酸利用的改变能够直接导致高级醇形成的减少。此外，去碳酸基反应对酮酸生成高级醇可能也是必要的，这个反应受到溶解的CO2影响。另外一组具有芳香味的挥发性醋酸酯是由乙酰基转移酶催化相应的醇和辅酶A之间的缩合反应形成的。由于抑制细胞的生长或直接对去碳酸基反应的直接影响，溶解的CO2 可能减少了培养基的有效成分，即高级醇和辅酶A ，从而减少了酯形成。Landaud等人研究表明，在CO2 压力下，酯的形成与相应的高级醇的单位体积的量的相关性比与其有效性的相关性更强。本研究中，细胞的生长和高级醇的形成都受到溶解的CO2 的牵制。两者联合的影响也许是造成在通入CO2 的固定化细胞发酵系统中的较低的酯生成原因。除了溶解的CO2 可能对挥发物的形成造成新陈代谢方面的影响外，通入的CO2 也可能在用气体剥离的方法是去除了部分挥发性物质。为了研究气体剥离影响的程度，在固定化细胞发酵系统中通以等量氮气（数据没有显示）。在与同样的未通如氮气的系统比较时，酯的形成减少但高级醇的形成增加。在麦芽汁培养基中，挥发物的去除程度是有亨利定律常数决定的。同样的，在气体剥离时酯比高级醇更易从麦芽汁培养基中去除。通以氮气时酯的减少量显示，在通以CO2 的固定化细胞发酵系统中，气体剥离的影响也是造成挥发性混合物减少的原因。在通以氮气时高级醇的增加显示在通气反应器中气体剥离可能增加了大量的传递物从而造成代谢活动的提高。总之，固定化模板的出现不仅为细胞提供了附着物，而且是CO2 气泡形成的成核位点，因此，使CO2 更容易去除。反过来说，这对酵母细胞的生理活动和重要的次级具有芳香味的次级产物的形成产生了深刻影响。在固定化细胞系统中酵母细胞生理的改变也许是CO2 抑制作用的结果，加之由于细胞或表面的接触和大量的传递物的限制使细胞发生改变。在固定化细胞中发酵终产物中混杂香味产物的组成变化与在游离细

南开大学 案例 二氧化碳在固定化啤酒酵母发酵过程中对挥发性芳香成分生成的影响_微生物发酵工程

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