微生物发醇工程室例教学 利用基因工程醇母生产抗疟疾药物前体一青燕酸 Dae-Kyun Rol,Eric M.Paradise2.,Mario Quelletl,Karl J.Fisher6.Karyn L Newnanl.Jobn M.Ndungu3, Kimberly A.Hol.Rachel A.Eachusl,Timothy S.Hani,Jares Kirby2,Michelle C.Y.Changl, Sydnor T.Nithers2.Yoichiro Shiba2,Richmond Sarpong3 Jay D.Keaslingl,2.4.5 (杨豫鲁用译) 摘要：殖疾这种疾病威粉着全球三至五亿人的健康，并且每年柔死超过一百万的人口，抗药原虫突 变系P1as©diun falcipa2,3的出现更严重l碍了对这种疾病的控制。虽然人工合成的抗疟药以及相 关疫苗己经出现，但其针对疟疾的治疗效果仍需经受严格的略床检验4.5。而青篇素，一种从Art■s1 aL(药科植物，俗称青喜)中提炼出来的倍半内酯环内过氧化物(C-15倍半格)，对抗药性疟原虫 PIas©diun spp的抑制效果妻常明显。呵替的是其供给量受自然因素等各方面限制，疟疾患者大都难以承 受其昂贵的价格6，青篇素的人工全合成也非常困难，而且花费很大7，不过利用微生物工程发醇合成其 前体青高酸（一种合成青富素的可靠来源），却是一个相对来说比较康价、环保和高效的办法8,9。这里 我门将介留如何通过基因工程途径支迹电清酵母使其高效合成青蕊酸（最高可达100/L):对其甲羟成酸 途径进行调控，并且转入编码orphadie(等价于ohn-4,I1-diem0,合成青篇酸及青其素的最 直接的前体原料)合解和一种特异的细胞色素P50酶(CYP?1WI)的基因。这两种酶均源自青驾，而且后 者经过三步氧化作用将anorpha-L,11-diee转变成青焉酸。青蒿酸合成后被转运到胞外并用着在酵母外 表面上，这意味着通过简单且廉价的纯化过程就可以获得目标产物。尽管这种基因工程醇母合成青驾酸的 能力相对于青落来说己经十分显著，仍需急切解决问题的是如何提高其生产效率从而扩大至工业规板生 产，以便可以生产出足够多的青蒿酸来降低现有青蒿素的价格。让青篙素综合疗法可以广泛地被应用到对 老疾的治疗中去。 内容：我们通过三个步骤构建能合成青蕊酸的基因工程酵母，(1)改造酵母焦磷酸法尼酯(P)生物 合成途径中的相关基因，增加下P的合成并且设法减少它作为固醇类物质的前体去合成因醇：(2)将青离 中的orphadiene合南基因S转入到高P生产株中，从而转化FP为anorphadiene:(3)克隆青高 中特异的细色素P4O0酶基因（这种酶通过三步氧化将amorphadiene氧化成青蒿酸）并使其在 0 hadiene生产株内表达（见图1）。青富素生物合成的第一步反应由AM510催化，它己经技鉴定并且 用于在大肠杆菌
微生物发酵工程案例教学 1 利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体--青蒿酸 Dae-Kyun Ro1*, Eric M. Paradise2*, Mario Ouellet1, Karl J. Fisher6, Karyn L. Newman1, John M. Ndungu3, Kimberly A. Ho1, Rachel A. Eachus1, Timothy S. Ham4, James Kirby2, Michelle C. Y. Chang1, Sydnor T. Withers2,Yoichiro Shiba2, Richmond Sarpong3 & Jay D. Keasling1,2,4,5 （杨豫鲁翻译） 摘要：疟疾这种疾病威胁着全球三至五亿人的健康，并且每年杀死超过一百万的人口。抗药疟原虫突 变系 Plasmodium falciparum2,3 的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。虽然人工合成的抗疟药以及相 关疫苗已经出现，但其针对疟疾的治疗效果仍需经受严格的临床检验 4，5。而青蒿素，一种从 Artemisia annua L（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15 倍半萜），对抗药性疟原虫 Plasmodium spp 的抑制效果非常明显。可惜的是其供给量受自然因素等各方面限制，疟疾患者大都难以承 受其昂贵的价格 6。青蒿素的人工全合成也非常困难，而且花费很大 7。不过利用微生物工程发酵合成其 前体青蒿酸（一种合成青蒿素的可靠来源）,却是一个相对来说比较廉价、环保和高效的办法 8，9。这里 我们将介绍如何通过基因工程途径改造啤酒酵母使其高效合成青蒿酸（最高可达 100ug/L）：对其甲羟戊酸 途径进行调控，并且转入编码 amorphadiene（ 等价于 amorpha-4,11-diene，合成青蒿酸及青蒿素的最 直接的前体原料）合酶和一种特异的细胞色素 P450 酶(CYP71AV1)的基因。这两种酶均源自青蒿，而且后 者经过三步氧化作用将 amorpha-4,11-diene 转变成青蒿酸。青蒿酸合成后被转运到胞外并附着在酵母外 表面上，这意味着通过简单且廉价的纯化过程就可以获得目标产物。尽管这种基因工程酵母合成青蒿酸的 能力相对于青蒿来说已经十分显著，仍需急切解决问题的是如何提高其生产效率从而扩大至工业规模生 产，以便可以生产出足够多的青蒿酸来降低现有青蒿素的价格，让青蒿素综合疗法可以广泛地被应用到对 疟疾的治疗中去。 内容:我们通过三个步骤构建能合成青蒿酸的基因工程酵母：（1）改造酵母焦磷酸法尼酯（FPP）生物 合成途径中的相关基因，增加 FPP 的合成并且设法减少它作为固醇类物质的前体去合成固醇；（2）将青蒿 中的 amorphadiene 合酶基因 ADS 转入到高 FPP 生产株中，从而转化 FPP 为 amorphadiene；（3）克隆青蒿 中特异的细胞色素 P450 酶基因（这种酶通过三步氧化将 amorphadiene 氧化成青蒿酸）并使其在 amorphadiene 生产株内表达（见图 1）。青蒿素生物合成的第一步反应由 ADS10 催化，它已经被鉴定并且 用于在大肠杆菌
微生物发酵工程室例教学 Simple sugar 物牌解地径 ADS:Amorphadiene合蒋 CYF71AV1.:细胞色素P450酶的一种，三步 意比H Acetyl--COA乙N辅酶A CPK: 到胞希P45O氧化还原酶CYP71AV1 ERG1Q解丽 Amorpha-4.11-diene 5 Acetoacety-CoA之t艺CoA ADS ↓ ERG13 HMG-COA品营品：基 13 2×4保跟原聘 CYP71AV1/CPR Mevalonate二是甲基成想 ERG12 Mevalonate-P。一裤银置ra CYP71AV1/CPR ERG8 Mevalonate-PPs一米转我VA 异构 ERGI9 on-enzymatic IDI IPP DMAPP CYP71AV1/CPR ERG20 Ate报aald ERG20 物购理去配脂 FPP Met- erg9::PMET-ERG9 Sg细n8蜜场 8em-被08s ER01.7.11.2425.6,235.4 Ergosterol米m吨 Ar装nn 图1|图中所示为同时表达CYP71AY1和CP限的基因工程啤酒厨母菌株PY224中青落酸的合成途径。 蓝颜色显示的是率酒酵母甲羟戊酸合成途径中被直接正调节的基因：紫色显示的是因p心2-1表达被间接 正调节的基因：红线折示菌株PT224中被抑制的G9:绿色箭头指示从焦南酸法呢酯到青驾酸的生物合 成途径，这条途径己经从青鳶被完全引入到啡酒醇母当中，在CP?1Y1和PR共同作用下经过三步氧化 将anorphadiene转变为青蒿酸。途径中间产物IPP,APP和GFP分别代表异2烯焦精酸雷、二甲基丙稀 焦南酸酯和焦磷酸精牛儿酯。 中合成anor phadienell.为了确定对是否要促进细胞内FT甲的合成，我们将5基因插入由GAL】府 动子拉制转录的飞25质较中，然后在酵母细胞中表达，结果是示单独转入6基因的酵母只合成少量 的anorphadiene(图2，商株EPY201,4.4/L)。 2
微生物发酵工程案例教学 2 图 1| 图中所示为同时表达 CYP71AV1 和 CPR 的基因工程啤酒酵母菌株 EPY224 中青蒿酸的合成途径。 蓝颜色显示的是啤酒酵母甲羟戊酸合成途径中被直接正调节的基因；紫色显示的是因 upc2-1 表达被间接 正调节的基因； 红线指示菌株 EPY224 中被抑制的 ERG9；绿色箭头指示从焦磷酸法呢酯到青蒿酸的生物合 成途径，这条途径已经从青蒿被完全引入到啤酒酵母当中，在 CYP71AV1 和 CPR 共同作用下经过三步氧化 将 amorphadiene 转变为青蒿酸。途径中间产物 IPP, DMAPP 和 GPP 分别代表异戊烯焦磷酸酯、二甲基丙烯 焦磷酸酯和焦磷酸牻牛儿酯。 中合成 amor phadiene11。为了确定对是否要促进细胞内 FPP 的合成，我们将 ADS 基因插入由 GAL1 启 动子控制转录的 pRS425 质粒中，然后在酵母细胞中表达，结果显示单独转入 ADS 基因的酵母只合成少量 的 amorphadiene（图 2，菌株 EPY201，4.4mg/L）
常生物发醇工程室例教学 150 120 笔 90 60 30 0 EPY201 EPY208 EPY210 EPY225 EPY213 EPY219 EPY224 S.cerevisiae strain 图2|柱状图显示基因政造过程不同阶段库清醇母菌株的anorphadiene合成能力，这些茵株的详细介 祁请见正文。为减小实验误差，均在月一条件下培养144小时后取样测定，anorphadi聊合成水平也棱定 量化。纵坐标表示总产量，为平均值土标准差（如3》。 所以，为了提高啤酒酵母合成anorphadiene的隐力，我们对P叩合成途径进行了总共五次的基因工 程改造。几个与聊合成相关的基因的表达被正测控，而另外儿个促使平转变成州醇的基因被负测控。 同时为了保证宿主菌株的速传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过染色体融合进行的。具体 过程如下：首先。将一种截短的水溶性酶3-羟基一3-甲基一戊二酰辅酶A还原酶（我们所学生化书中为译为 B-羟基-B-甲基-戊二脱辅解A还原酶，简移Cl还原酶，又简称tR12,是倒醇合成的限速酶》过 表达，可提高arorphadiene的合成产量近五倍（图2，菌株四208）：其次，利用一个 聊thicminerepressib1e启动子ET3)13,通过对编码鲨稀合酶（国醇生物合成途径中PP合成后第一 步)的E9基因遗行免调控，可将anor phadiene的合成量再增加两倍（图2，商株PY225):然后，尽 管2-1，一个可以如强℃2（啤清酵母中调节国醇合成的一个的通用转录因子）14活性的半暴性突 变体等位基因，在已有茵株P20g背景下过表达（图2，菌株即T210)对anorphadiene合成的提高起的 作用并不显著，国结合对B9甚因的负调控，其过表达可将anorphadiene的合成量提高到105/L(图 2,菌株EPT213):再次，在酵母牵色体更运处在转进一个tGP拷贝可以将将其合成量再增加50%达到 149g/L.(图2，茵株PT219:最后，虽然编码FP甲合酶的5因(RC20)过表达对0 phadiene合成 总量（图2，菌株P224)的提高效果丰常小，但在细型密度降低的情况下其合成量却可增加10俏。将所 有这些对基因的修饰综合在菌株P224上，anorphad iene的合成量已经达到了153ag/L,是之前所报 道这种倍半篇（桶）最大合成水平的几乎500倍15
微生物发酵工程案例教学 3 图 2 |柱状图显示基因改造过程不同阶段啤酒酵母菌株的 amorphadiene 合成能力，这些菌株的详细介 绍请见正文。为减小实验误差，均在同一条件下培养 144 小时后取样测定，amorphadiene 合成水平也被定 量化。纵坐标表示总产量，为平均值±标准差(n =3)。 所以，为了提高啤酒酵母合成 amorphadiene 的能力，我们对 FPP 合成途径进行了总共五次的基因工 程改造。几个与 FPP 合成相关的基因的表达被正调控，而另外几个促使 FPP 转变成固醇的基因被负调控。 同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过染色体融合进行的。具体 过程如下：首先，将一种截短的水溶性酶 3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶 A 还原酶（我们所学生化书中为译为 β-羟基-β-甲基-戊二酰辅酶 A 还原酶，简称 HMGCoA 还原酶，又简称 tHMGR12，是固醇合成的限速酶）过 表达，可提高 amorphadiene 的合成产量近五倍（图 2，菌株 EPY208）；其次，利用一个 methioninerepressible 启动子 (PMET3)13，通过对编码鲨稀合酶（固醇生物合成途径中 FPP 合成后第一 步）的 ERG9 基因进行负调控，可将 amor phadiene 的合成量再增加两倍（图 2，菌株 EPY225）；然后，尽 管 upc2-1, 一个可以加强 UPC２（啤酒酵母中调节固醇合成的一个的通用转录因子）14 活性的半显性突 变体等位基因，在已有菌株 EPY208 背景下过表达（图 2，菌株 EPY210）对 amorphadiene 合成的提高起的 作用并不显著，但结合对 ERG9 基因的负调控，其过表达可将 amorphadiene 的合成量提高到 105mg/L（图 2，菌株 EPY213）；再次，在酵母染色体更远处在转进一个 tHMGP 拷贝可以将将其合成量再增加 50%达到 149mg/L（图 2，菌株 EPY 219）；最后，虽然编码 FPP 合酶的基因（ERG20）过表达对 amorphadiene 合成 总量（图 2，菌株 EPY224）的提高效果非常小，但在细胞密度降低的情况下其合成量却可增加 10%。将所 有这些对基因的修饰综合在菌株 EPY224 上，amorphad iene 的合成量已经达到了 153mg/L , 是之前所报 道这种倍半萜(烯)最大合成水平的几乎 500 倍 15
微生物发醇工程室例教学 (王易龙甜译》 现在我门已经得到了可以高效合成morphadiene的醇母商株，但为修将anor phadiene转变成青驾 酸，我们还需要找到并分离出青蒿中编码催化anorphadiene转变成青蒿酸的酶的基因。青高素是一种倍 半精内酯生物，这些生物在菊科植物中普遍存在，是一类十分有特性的细次级代谢产物。我们假定 袭科植物在半倍半蓓内酯的合成的前几步中利用的是源于同一祖先的合成酶，据此对菊科植物进行了一次 基因组比较分析。由于先前已经有文章报道过对青蒿的无细胞化验，并且证明在青蒿中是一种特异的细胞 色素P450酶7对anorphadie ne进行专一性羟化（图1）。我们直接从由向日葵和莴苣这两种菊科作物提 供的基因数据构建的己表达序列标志(EST)数据库中检素得到细胞色素P450己表达序列标志(STs)。 然后通过使用针对CP71和C2家疾(P450酶在菊科植物中最多的两个家族》高度特异的简并引物，从 青蒿毛状体细胞的互补库中分离出几个特定的P40片段。接着利用园ST分析法18将这些片段与向 日葵和莴苣的ESTs比对，我们惊奇地发现有一个青菖P40基因片段与米自以上两种植物的未知功橙Ss 序列非常相似（氢基酸水平上达相似度达85-88路》，而同其他非菊科植物的P50序列相似度较低（氨基酸 水平上小于5作)。这表明相对于◆菊料植物，P50基因在这三个亲缘关系较运的菊科植物属中是高度保 守的。因此，从青富中分离出的这段P40基因是编码菊科保字性倍半萜内酯生物合成酶一个非常好的候 选者。 随后相应的完整P450DNM(CP71AI),一个编码95个氨基酸的开放间读框，成功从青其中分离获 得。系饶进化分析法显示CPT1A1和其他的P450(像霍化类单蓝羟化的CYP71D13/1819、催化倍半萜 经化的CYP712020以及二椭类化合物轻化的CYP?1D1621)有根近的亲锋关系。这进一步表明从青蒿中获 得的P450在秸类化合物代谢中存在的潜在作用。为了保证异源表达的CYPT1AY1可以发挥正常功能，协同 它进行氧化还原反应的天然配体，P:细胞色素P50氧化还原南(CP限)，月样从青蒿中成功分离，并 且其生化活性己经在体外被证实。（细散色素e和NP州的米氏常数(K分别为4.3±0,7口M和23,0 土4.4卫M(平均值±标准差，n=3), 在配体分子C的参与下，我们研究了在活细胞体内CP71Av1是否可以催化anorphadie ne转变为 多领氧化产物：转基因醇母株PY221中被转入了一个整合有CP吸和CYPT1AV1基因并且由半乳糖诱导启动 子调控的基因载体，经半乳糖的请导表达后。用瑟对醇得细围体和培养基分别进行抽提。并对情分进行气 象色谱一颜谱联合分析(GC-s)。分析结果显示，在同时表达CP71AY1和CPR的细围株EPY224细酸体 及其培养基中，一个独特的单色谱峰被检测出，但是在具表达C霍的22中并未检测到这个峰，并且， 几乎9群的这种特异化合物是米潭于细胞体的。而且这种亿合物的电子碰撞质进和保留时间与从青蒿中提 取的青高酸的完全吻合（图3）：在据瓶培养条件下，同时表达CY?1AY1和CR的224菌株青离酸产 量为32±13/L(平均数土标准差，霸=)。更为重要的是。其中间代谢产物，青篇醇和青葛醛在细 4
微生物发酵工程案例教学 4 （王易龙翻译） 现在我们已经得到了可以高效合成 amorphadiene 的酵母菌株，但为能将 amor phadiene 转变成青蒿 酸，我们还需要找到并分离出青蒿中编码催化 amorphadiene 转变成青蒿酸的酶的基因。青蒿素是一种倍 半萜内酯衍生物，这些衍生物在菊科植物中普遍存在，是一类十分有特性的细胞次级代谢产物。我们假定 菊科植物在半倍半萜内酯的合成的前几步中利用的是源于同一祖先的合成酶，据此对菊科植物进行了一次 基因组比较分析。由于先前已经有文章报道过对青蒿的无细胞化验，并且证明在青蒿中是一种特异的细胞 色素 P450 酶 17 对 amorphadie ne 进行专一性羟化（图 1）。我们直接从由向日葵和莴苣这两种菊科作物提 供的基因数据构建的已表达序列标志（EST）数据库中检索得到细胞色素 P450 已表达序列标志（ESTs）。 然后通过使用针对 CYP71 和 CYP82 家族（P450 酶在菊科植物中最多的两个家族）高度特异的简并引物，从 青蒿毛状体细胞的互补 DNA 库中分离出几个特定的 P450 片段。接着利用 BLAST 分析法 18 将这些片段与向 日葵和莴苣的 ESTｓ比对，我们惊奇地发现有一个青蒿 P450 基因片段与来自以上两种植物的未知功能 ESTs 序列非常相似（氨基酸水平上达相似度达 85-88%），而同其他非菊科植物的 P450 序列相似度较低（氨基酸 水平上小于 50%）。这表明相对于非菊科植物，P450 基因在这三个亲缘关系较远的菊科植物属中是高度保 守的。因此，从青蒿中分离出的这段 P450 基因是编码菊科保守性倍半萜内酯生物合成酶一个非常好的候 选者。 随后相应的完整 P450cDNA（CYP71AV1），一个编码 495 个氨基酸的开放阅读框，成功从青蒿中分离获 得。系统进化分析法显示 CYP71AV1 和其他的 P450s（像催化类单萜羟化的 CYP71 D13/1819、 催化倍半萜 羟化的 CYP71D2020 以及二萜类化合物羟化的 CYP71D1621）有很近的亲缘关系。这进一步表明从青蒿中获 得的 P450 在萜类化合物代谢中存在的潜在作用。为了保证异源表达的 CYP71AV1 可以发挥正常功能，协同 它进行氧化还原反应的天然配体，NADPH：细胞色素 P450 氧化还原酶（CPR），同样从青蒿中成功分离，并 且其生化活性已经在体外被证实。(细胞色素 c 和 NADPH 的米氏常数(Km)分别为 4.3±0.7 μM 和 23.0 ±4.4 μM (平均值 ±标准差, n ＝3 ))。 在配体分子 CPR 的参与下，我们研究了在活细胞体内 CYP71AV1 是否可以催化 amorphadie ne 转变为 多级氧化产物：转基因酵母株 EPY224 中被转入了一个整合有 CPR 和 CYP71AV1 基因并且由半乳糖诱导启动 子调控的基因载体，经半乳糖的诱导表达后，用醚对酵母细胞体和培养基分别进行抽提，并对馏分进行气 象色谱—质谱联合分析(GC–MS)。分析结果显示，在同时表达 CYP71AV1 和 CPR 的细胞株 EPY224 细胞体 及其培养基中，一个独特的单色谱峰被检测出，但是在只表达 CPR 的 EPY224 中并未检测到这个峰，并且， 几乎 95%的这种特异化合物是来源于细胞体的。而且这种化合物的电子碰撞质谱和保留时间与从青蒿中提 取的青蒿酸的完全吻合（图 3）。在摇瓶培养条件下，同时表达 CYP71AV1 和 CPR 的 EPY224 菌株青蒿酸产 量为 32 ± 13 mg/L (平均数 ±标准差, n＝7)。更为重要的是，其中间代谢产物，青蒿醇和青蒿醛在细
微生物发酵工程室例教学 胞体和培养基中核检测到的量几乎可以忽略（青驾醇的量比青葛素酸的路还少，并且根本没有青离盛敲校 测出) 我们迁实，通过用碱性缓冲液（为9的TisL缓冲液中添加1.2W的山梨醇》清洗粮体沉淀物， 绝大部分合成的青蒿酸()9)可以面被分离出，面且冲洗之后细胞体和培养基中的残留量仅为2。青高 酸不仅可以被高效的转移到细胞外，且在酸性条件下经过质子化后会被束铺在细鞋表面。利用这个特点制 定了一种便捷提纯方法：用酷对清洗缓冲液进行抽提，然后经过一步简单的凝胶柱层新分离袖提物。就可 以得到纯度高于5的青驾酸。在一个一升发解罐中，青蒿酸的产量为115g,而通这种方法的，我们可 以得到76的提纯产物。最重要的是，经1用ad1C原子核磁共振检测显示，这种酵母合成青蒿酸与从 青落中直接提取的青落酸分子结构完全一样。并且同先前的文献报道十分吻合2,3。因此，可以确定我 们所得到的这株转基因酵母能够直接合成结构功修上完全正确的青篇酸。 (周景峰翻译) 转基因督母在生产青富酸时雷要的生物量与青离相比。其细傲体干重的4.销相当于青富中1，纳的青 酸和0.16选的青驾素，但是所需的时间非常短（酵母-5天，面青蒿则需要几个月的时间）。因此，转基 因醇母南珠的单位生产效率比青高高了近两个数量级。 P450酶三步氧化法曾在植物赤霜素生物合成途径中有过服道24,5.我们通过体外酶法检测CYP71AW1 是否在a@phadiese转化为青燕酸的三个过程中都起到催化作用。从啤清酵母商株F阳9g中分离微体， 这些微体仅表达豫或者同时表达C邪和CPT1AW1,将微体在不月的合成途径中间体(anorphadiene,青 篇醇，青离醛)条件下进行培养（图4，对塑组微体仅表达C呢，没有霍化任何合成途径中同体以到更高 级的氧化产物。但是我们发现包含CYTT1V门和CF曜的微体将norphadiene、青高醇和青高醛更如高效地 转化成了青驾酸。这些体外实验毫无疑问地证明：重组CPT1WI可以在amorphadiene的C12位置偃化三 次氧化反应。虽燃先输己经有报道。使用青落蛋白提取物的体外酶法测定证明可溶性的醇醛脱氢酶和一种 C11,13双健还原酶（作用于醛）参与青高素的生物合成17。我们不样除在青再中存在其他的醇醛税氢酶 参与的催化反应，但是体外实验中重组的CYPT1AW1将orpha--4,11-dine高效转化为青篇酸，完全最 示出膜结合、多功性的CT1W1是青菖素的生物合成中的关健促成因素。 5
微生物发酵工程案例教学 5 胞体和培养基中被检测到的量几乎可以忽略（青蒿醇的量比青蒿素酸的 5%还少，并且根本没有青蒿醛被检 测出）。 我们证实，通过用碱性缓冲液（pH 为 9 的 Tris-HCL 缓冲液中添加 1.2M 的山梨醇）清洗胞体沉淀物， 绝大部分合成的青蒿酸（>96%）可以而被分离出，而且冲洗之后细胞体和培养基中的残留量仅为 2%。青蒿 酸不仅可以被高效的转移到细胞外，且在酸性条件下经过质子化后会被束缚在细胞表面。利用这个特点制 定了一种便捷提纯方法：用醚对清洗缓冲液进行抽提，然后经过一步简单的凝胶柱层析分离抽提物，就可 以得到纯度高于 95%的青蒿酸。在一个一升发酵罐中，青蒿酸的产量为 115mg，而通这种方法的，我们可 以得到 76mg 的提纯产物。最重要的是，经 1H and13C 原子核磁共振检测显示，这种酵母合成青蒿酸与从 青蒿中直接提取的青蒿酸分子结构完全一样，并且同先前的文献报道十分吻合 22，23。因此，可以确定我 们所得到的这株转基因酵母能够直接合成结构功能上完全正确的青蒿酸。 （周景峰翻译） 转基因酵母在生产青蒿酸时需要的生物量与青蒿相比，其细胞体干重的 4.5%相当于青蒿中 1.9%的青 蒿酸和 0.16%的青蒿素，但是所需的时间非常短（酵母 4-5 天，而青蒿则需要几个月的时间）。因此，转基 因酵母菌珠的单位生产效率比青蒿高了近两个数量级。 P450 酶三步氧化法曾在植物赤霉素生物合成途径中有过报道 24，25。我们通过体外酶法检测 CYP71AV1 是否在 amorphadiene 转化为青蒿酸的三个过程中都起到催化作用。从啤酒酵母菌株 YPH499 中分离微体， 这些微体仅表达 CPR 或者同时表达 CPR 和 CYP71AV1。将微体在不同的合成途径中间体（amorphadiene，青 蒿醇，青蒿醛）条件下进行培养（图 4）。对照组微体仅表达 CPR，没有催化任何合成途径中间体以到更高 级的氧化产物。但是我们发现包含 CYP71AV1 和 CPR 的微体将 amorphadiene、青蒿醇和青蒿醛更加高效地 转化成了青蒿酸。这些体外实验毫无疑问地证明：重组 CYP71AV1 可以在 amorphadiene 的 C12 位置催化三 次氧化反应。虽然先前已经有报道，使用青蒿蛋白提取物的体外酶法测定证明可溶性的醇醛脱氢酶和一种 C11，13 双键还原酶（作用于醛）参与青蒿素的生物合成 17。我们不排除在青蒿中存在其他的醇醛脱氢酶 参与的催化反应，但是体外实验中重组的 CYP71AV1 将 amorpha-4, 11-diene 高效转化为青蒿酸，完全显 示出膜结合、多功能的 CYP71AV1 是青蒿素的生物合成中的关键促成因素
常生物发醇工程室例教学 8 CPR/CYP71AVI CPR 思 A. Time (min) 15 121 Pnk1(只T=13,2) Yenst product 3 240 7 105 1超超 138 21 6607 146 102 173 201 233 121 P8ak2(只T-13.01) 93 78 10E 130 102 G7 145 图3：气相层析质游法(GC5)分析从青驾其和转基因醇母中获得的青其酸 表达C深或者豫和C71AV门的啤酒阍母蘭株细胞体使用碱性缓冲液冲洗后，经酸化和醒抽提提纯。 青高酸用乙烷从青高的叶子里提取。在进行GC-5分析之前，每个样品的甲酯化产物需经三甲基硅烷-重 氨甲烷提前处理。内标物(15)是一辛基苯甲酸的甲酯化物。 b,C。从酵母(b)和青嵩(c)中得到的青篇酸的质语和保窗时间。T表示保留时间，以分钟计
微生物发酵工程案例教学 6 图 3：气相层析质谱法（GC-MS）分析从青蒿蒿和转基因酵母中获得的青蒿酸 表达 CPR 或者 CPR 和 CYP71AV1 的啤酒酵母菌株细胞体使用碱性缓冲液冲洗后，经酸化和醚抽提提纯。 青蒿酸用乙烷从青蒿的叶子里提取。在进行 GC-MS 分析之前，每个样品的甲酯化产物需经三甲基硅烷-重 氮甲烷提前处理。内标物（IS）是 4-辛基苯甲酸的甲酯化物。 b，c．从酵母（b）和青蒿（c）中得到的青蒿酸的质谱和保留时间。RT 表示保留时间，以分钟计
微生物发醇工程室例教学 COMOAV CYP7IAVI Control CYP71AVI Control 月otuntion time (min 1 图4：体外酶法测定CYPT1A1的活性。从啤酒酵厚黄株YP出9的中分离获得的微体表达C豫（对塑组） 或者CPR和CP71 AVI (CYP71AI组D. -c.每一种南的测定分别加入(a)10 M amorphadiene,(b)25W青蒿醇，或者《c)25喇青蒿醛. 底物的色游峰用星号标出。艇提取物经过钉生，并用CCs在不同的较子模式下分析(z:121,189, 204,218,220和248)。酶反应的产物按盟预期得到：1，青落醇（保留时间13.20分钟）12，青落征（保 窗时间11.79分钟)：3，青篙酸（保留时间13.58分钟，甲酯化后检测） 总的来说，我们采用改迹叩生物合成途径的方法获得了能高水平生产青燕酸的碑酒醇母菌株。该方 法通过表达arhd1ee合成酶。一种新型的细脑色素P4S0和与之相关的米自青篇的氧化还原酶米提高 青高酸的产量。据了解，相关转化青离酸到青露素或其他派生物的化学方法可能还有许多传改进之处8,9， 但微生物法生产青高酸是获阁此类高效抗茫疾药物切实可行的方法。保守分析证明，在使产品效价最优化 的情况下，青蒿素结合治疗法将会远远降低于现在用于庭疾治疗的价格，除了节省费用之外，这种生物合 成方法不会受到像天气和成治气候等因素的影响，但这些因素可能会对植物的培育造成影响。进一步说， 从微生物里得到的青燕酸可以采用对环境友好的方式提取。面不用担心像植物能够产生其他的蓝烯致使产 物受到污染，从而减少了纯化的费用， 方法 对于牢酒酵母的增殖与鉴定、。CP711和CP第基因的克隆以及青蒿醇和青酱醛的半合成等实验过程 中所使用的手段方法的详细描述请见补充信息。 化学和植物材料：青蒿酸标准品购买于pin Chenicals公司或者直接用己烷从青蒿叶片萃取，青
微生物发酵工程案例教学 7 图 4：体外酶法测定 CYP71AV1 的活性。从啤酒酵母菌株 YPH499 中分离获得的微体表达 CPR（对照组） 或者 CPR 和 CYP71AV1(CYP71AV1 组)。 a-c．每一种酶的测定分别加入（a）10µM amorphadiene，（b）25µM 青蒿醇，或者（c）25µM 青蒿醛。 底物的色谱峰用星号标出。醚提取物经过衍生，并用 GC-MS 在不同的粒子模式下分析（mlz：121，189， 204，218，220 和 248）。酶反应的产物按照预期得到：1，青蒿醇（保留时间 13.20 分钟）；2，青蒿醛（保 留时间 11.79 分钟）；3，青蒿酸（保留时间 13.58 分钟，甲酯化后检测） 总的来说，我们采用改造 FPP 生物合成途径的方法获得了能高水平生产青蒿酸的啤酒酵母菌株。该方 法通过表达 amorphadiene 合成酶，一种新型的细胞色素 P450 和与之相关的来自青蒿的氧化还原酶来提高 青蒿酸的产量。据了解，相关转化青蒿酸到青蒿素或其他派生物的化学方法可能还有许多待改进之处 8，9， 但微生物法生产青蒿酸是获得此类高效抗疟疾药物切实可行的方法。保守分析证明，在使产品效价最优化 的情况下，青蒿素结合治疗法将会远远降低于现在用于疟疾治疗的价格。除了节省费用之外，这种生物合 成方法不会受到像天气和政治气候等因素的影响，但这些因素可能会对植物的培育造成影响。进一步说， 从微生物里得到的青蒿酸可以采用对环境友好的方式提取，而不用担心像植物能够产生其他的萜烯致使产 物受到污染，从而减少了纯化的费用。 方法： 对于啤酒酵母的增殖与鉴定、CYP71AV1 和 CPR 基因的克隆以及青蒿醇和青蒿醛的半合成等实验过程 中所使用的手段方法的详细描述请见补充信息。 化学和植物材料：青蒿酸标准品购买于 Apin Chemicals 公司或者直接用己烷从青蒿叶片萃取。青蒿
微生物发精工程室例教学 植株被裁培在加州大孕怕克利分校的温室当中，并且都是从种子开始培育的。 GC—5法分析Anorphadiene:用GC一5对不同株系的电酒酵母的Anorphadiene合成量进行测定， 使用十二烧阻止Amorphadiene的挥发，为了定量衡景Anorphadieme产量水平，用于测定标准曲线的 Aaorphadiene(g0%纯)是通过大弱杆菌菌株发醇制备的. 青燕酸的胞内发醇，纯化及化学分析：将经过谈培养的在600m(600)下吸光度达到0.06的m224 商株（己经按转入SCURA:CPR成者ESRA:CPR/CPT1AW1)接种到25l合成培养基中。该培养基不 含组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和尿嗜暖，但是添加有Q,2气的笔萄糖、L.8器的半乳糖以及1l定量的甲晓 氨酸。300C下恒温培养1D小时，然后将培养混合物进行离心，留下细园体。再用50Tris-C1缓冲液 (H9.0)冲洗细鞋体，加入2W的1将援冲液的阳调至2.0，用混入4-烷基苯甲酸(10ug/1)的乙 酸乙酯进行萃取。萃取喻分经50】2型的四甲基硅烷-重氨甲烧和10%的甲醇粉生。在进行GC-5分析前。 产物还要经过以(1：1)的腿和戊烷为洗税剂的凝胶色谱提纯。 (阳震翻译) 最后，提纯的产物经气相色谱质游仪(70eV,Agilent Technologies)分析，毛细管桂为5(a,25 意米内径×025μ×30a,J7 Scientific).气相色谱的如热程序从80℃（保持2分钟），以每分钟20C 的梯度递增到140℃。产品分离时由5℃/：i的速度增如到220℃。采用火焰电离色谱检测标准品时为了 定量，没有使用相同的气相加热程序对柱子进行净化。 发酵及产物的核磁共振分析：使用I升的生物反应器(New-Brunswick Scientific),在30℃的条件下， 培养酵母菌93个小时。2汽的半乳糖的诱导酵母细胞，600下测心值为1.7，最终的细胞浓度D值600 达到5.0。搅速度从100r即变到500即，每分钟通氧0.5L,使得溶氧量始终保特在40，青蒿酸使用 碱选的方法从细围沉淀物中提取出来。再使用含有T阵的乙烷，的乙酸乙酯和的乙酸的硅胶管柱提 纯，分离得到的青蕊酸（纯度大于95%）的结构采用Cal1 ege of Cheaistry眼Facility at the University of California提供的1日和13CN500W:楼磁共振仪进行分析. 体外酶法测定：用重组质粒ESCURA:CPR或者ESCURA:CPR/CPT1AY1与1升的啤酒酵母PH499培 养物，加入2答的半乳糖转化4小时。微体使用聚乙二醇法沉淀，然后超高速离心去除前面提到的数里 的蛋白质杂质26。取大约500%的微体蛋白，100山p7.5的晴酸如暖冲液，10或者25的培养基， 100WND刚和一个NMF用的重建体系(5山葡萄糖6-磷酸和2个单位的葡萄糖8-磷酸脱氢酶)，反应在 24℃下轻微搅并作用24小时。反应完成之后加酸至出为2然后使用乙醒抽提。产物采用与上面所运相 同的气相如热程序。使用包含了相对于产物典型的六种离子(121,189,201,220和28)的固定离子检 测(SIM)法进行检测， 更过补充信息请查间在线网页.ature.coa/nature, 8
微生物发酵工程案例教学 8 植株被栽培在加州大学伯克利分校的温室当中，并且都是从种子开始培育的。 GC—MS 法分析 Amorphadiene：用 GC—MS 对不同株系的啤酒酵母的 Amorphadiene 合成量进行测定， 使用十二烷阻止 Amorphadiene 的挥发。为了定量衡量 Amorphadiene 产量水平，用于测定标准曲线的 Amorphadiene（90%纯）是通过大肠杆菌菌株发酵制备的。 青蒿酸的胞内发酵，纯化及化学分析：将经过预培养的在 600nm（A600）下吸光度达到 0.05 的 EPY224 菌株（已经被转入 pESCURA::CPR 或者 pESCURA::CPR/CYP71AV1）接种到 25ml 合成培养基中。该培养基不 含组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和尿嘧啶，但是添加有 0.2%的葡萄糖、1.8%的半乳糖以及 1mMol 定量的甲硫 氨酸。300C 下恒温培养 120 小时，然后将培养混合物进行离心，留下细胞体。再用 50mM Tris-HCl 缓冲液 （pH 9.0）冲洗细胞体，加入 2M 的 HCl 将缓冲液的 pH 调至 2.0，用混入 4-烷基苯甲酸（10ug/ml）的乙 酸乙酯进行萃取。萃取馏分经 50ul 2M 的四甲基硅烷-重氮甲烷和 10%的甲醇衍生。在进行 GC-MS 分析前， 产物还要经过以（1：1）的醚和戊烷为洗脱剂的凝胶色谱提纯。 （阳 震翻译） 最后，提纯的产物经气相色谱质谱仪（70eV，Agilent Technologies）分析，毛细管柱为 DB5（0.25 毫米内径 ×0.25µ×30m，J&W Scientific）。气相色谱的加热程序从 80℃（保持 2 分钟），以每分钟 20℃ 的梯度递增到 140℃。产品分离时由 5℃/min 的速度增加到 220℃。采用火焰电离色谱检测标准品时为了 定量，没有使用相同的气相加热程序对柱子进行净化。 发酵及产物的核磁共振分析:使用 1 升的生物反应器（New-Brunswick Scientific），在 30℃的条件下， 培养酵母菌 93 个小时。2%的半乳糖的诱导酵母细胞，600nm 下测 OD 值为 1.7，最终的细胞浓度 OD 值 A600 达到 5.0。搅拌速度从 100rmp 变到 500rmp，每分钟通氧 0.5L，使得溶氧量始终保持在 40%，青蒿酸使用 碱洗的方法从细胞沉淀物中提取出来，再使用含有 78%的乙烷，20%的乙酸乙酯和 2%的乙酸的硅胶管柱提 纯。分离得到的青蒿酸（纯度大于 95%）的结构采用 College of Chemistry NMR Facility at the University of California 提供的 1H 和 13C NMR500MHz 核磁共振仪进行分析。 体外酶法测定:用重组质粒 pESCURA::CPR 或者 pESCURA::CPR/CYP71AV1 与 1 升的啤酒酵母 YPH499 培 养物，加入 2%的半乳糖转化 24 小时。微体使用聚乙二醇法沉淀，然后超高速离心去除前面提到的细胞里 的蛋白质杂质 26。取大约 500µg 的微体蛋白，100mM pH 7.5 的磷酸加缓冲液, 10 或者 25µM 的培养基， 100µM NADPH 和一个 NADPH 的重建体系（5mM 葡萄糖-6-磷酸和 2 个单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）。反应在 24℃下轻微搅拌作用 24 小时。反应完成之后加酸至 pH 为 2，然后使用乙醚抽提。产物采用与上面所述相 同的气相加热程序。使用包含了相对于产物典型的六种离子（121，189，204，220 和 248）的固定离子检 测（SIM）法进行检测。 更过补充信息请查阅在线网页 www.nature.com/nature
常生物发醇工程室例教学 政谢： 感谢提供官方CYP数据的Nelson教授，进行从青高中提纯青驾酸工作的0ky教授和kPhee数授的， 感谢提供p着-B的LA.D.Si1va提供阳I27-3和的73的R.Y.anpton,提供Da3和阳36的J. Rine。感谢菊科基因组计划的R,1 chelmore和其也成员对本项目的支持，最后感谢梅林达-比尔盖菱基 金会、美国农业都、美国国家科学基金会、Institute for OneNorld Health、从ibene Foundation、 Iniversity of California Discovery Grant,.the Diversa Corporation提佚货金支持. 参考文献： [1]World Health Organization.World Malaria Report 2005.(WH0,Geneva.2005). [2]Korenromp,E.L.Willians,B.G.,Gouws,E..Dye,C.Snow.R V.Measurenent of trends in childhood malaria mortality in Africa:Anassessment of progress toward targets based on verbal autopsy.Lancet Infect.Dis.3,349--358 (2003). [3]Marsh,K.Malaria disaster in Africa.Lancet 352,924 (1998). [4]Hoffman,S.Save the children.Nature 430.940--941 (2004). [5]Vennerstrom,J.L.et al.Identification of an antimalarial synthetic trioxolane drug developaent candidate.Na ture 430,900--904 (2004). [6]Enserink,M Infectious diseases:Source of new hope against mlaria is in short supply.Science 307,33 (2005). [7]Schnid,G.Hofheinz,W.Total synthesis of Qinghaosu.J.Am.Chem.Soc.105,624--625 (1983). [8]Acton,N.Roth,R.J.O the comversion of dihydroartemisinic acid into artemisinin. J.0 rg.Chen57,3610--3614(19的2). [9]Haynes,R.K.Vonwiller,S.C.Cyelic peroxyacetal lactone,lactol and ether compounds. 5 patent5.310,946(1990. [10].Mercke,P..Bengtsson.M.,Bouwmeester,I.J.,Posthumus,M.A&Brodelius.P.E. Molecular cloning exp ressfon,and characterization of amorpha-4,11-diene symthase,a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Art emisia annua L.Arch.Biochem.Biophys.381,173--180 (2000). [11]Martin,V.J..Pitera.D.J.,Withers,S.T..Newman,J.D.Keasling.J.D.Engineering a mevalonate pathsa y in Escherichfa coli for production ofterpenoids.Nature Biotechnol.21, 796--802 (2003).12.Donald,K..Ha mpton,R Fritz,I.Effects of owerproduction of the catalyticdomain of 3-hydroxy-3-methylzlutaryI coenzym e A reductase on squalenesynthesis in
微生物发酵工程案例教学 9 致谢： 感谢提供官方 CYP 数据的 Nelson 教授，进行从青蒿中提纯青蒿酸工作的 Ockey 教授和 McPhee 教授的。 感谢提供 pδ-UB 的 N.A.Da.Silva, 提供 pRH127-3 和 pRH973 的 R.Y.Hampton,提供 pBD33 和 pBD36 的 J. Rine。感谢菊科基因组计划的 R. Michelmore 和其他成员对本项目的支持。最后感谢梅林达-比尔盖茨基 金会、美国农业部、美国国家科学基金会、Institute for OneWorld Health、Akibene Foundation、 University of California Discovery Grant、the Diversa Corporation 提供资金支持。 参考文献： [1] World Health Organization. World Malaria Report 2005. (WHO, Geneva, 2005). [2] Korenromp, E. L., Williams, B. G., Gouws, E., Dye, C. & Snow, R. W.Measurement of trends in childhood malaria mortality in Africa: Anassessment of progress toward targets based on verbal autopsy. Lancet Infect.Dis. 3, 349–-358 (2003). [3] Marsh, K. Malaria disaster in Africa. Lancet 352, 924 (1998). [4] Hoffman, S. Save the children. Nature 430, 940–-941 (2004). [5] Vennerstrom, J. L. et al. Identification of an antimalarial synthetic trioxolane drug development candidate.Na ture 430, 900–-904 (2004). [6] Enserink, M. Infectious diseases: Source of new hope against malaria is in short supply. Science 307, 33 (2005). [7] Schmid, G. & Hofheinz, W. Total synthesis of Qinghaosu. J. Am. Chem. Soc.105, 624–-625 (1983). [8] Acton, N. & Roth, R. J. On the conversion of dihydroartemisinic acid into artemisinin. J. Org. Chem. 57,3610 –-3614 (1992). [9] Haynes, R. K. & Vonwiller, S. C. Cyclic peroxyacetal lactone, lactol and ether compounds. US patent 5,310,9 46 (1994). [10].Mercke, P., Bengtsson, M., Bouwmeester, H. J., Posthumus, M. A. & Brodelius,P. E. Molecular cloning exp ression, and characterization of amorpha-4,11-diene synthase, a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Art emisia annua L. Arch.Biochem. Biophys. 381, 173–-180 (2000). [11] Martin, V. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D. & Keasling, J. D.Engineering a mevalonate pathwa y in Escherichia coli for production ofterpenoids. Nature Biotechnol. 21, 796–-802 (2003).12. Donald, K., Ha mpton, R. & Fritz, I. Effects of overproduction of the catalyticdomain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym e A reductase on squalenesynthesis in
微生物发醇工程室例教学 Saccharomyces cerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.63,3341--3344 [13]Gardner,R G.A Hampton,R.Y.A highly conserved signal controls degradation of 3-hydroxy-3-nethylglut aryl-coemzyre A (HMG-CaA)reductase in eukaryotes.J.Biol.Chen.274, 31671--31678(1999). 1[4.]Davies,B.S.J..Wang.H.S.&Rine,J.Dual activators of the sterol biosynthetic pathway of Saccharomyces cerevisiae:Similar activation/regulatory domins but different response rechanisms.Mol.Cell.Biol.25,7375--7385 (2005). [15]Jackson,B.E.,Hart-Wells,E.A.Matsuda.S.P.T.Metabolic engineering to produce sesquiterpenes in yeast.Org.Lett.5.1629--1632 (2003). [16]Seanan.F.C.Sesquiterpene lactones as taxoncnic characters in the Asteraceae.Bot. Rev,48,121--592(1982). [17]Bertea.C.M et al.Idemtification of intermediates and enzynes involved in the early steps of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua.Planta Med.71,40--47 (2005). [18】Altschul,.S.F,Gish,里，Miller,星.，Nyers,B.g.&Lipnan,D.J.Basic localalignment search tool.J.Mol.Biol.215.403--410 (1990). [19]Lupien.S..Karp,F..Wildung.M.Croteau.R.Regiospecific cytochrone P4501imonene hydroxylases from mint (Mentha)species:cDNA isolation,characterization,and functional expression of (2)-4S-limonene-3-hyd roxylase and (2)-4S-limonene-6-hydroxylase.Arch.Biochem. B10phy5368181--192(1999). [20]Ralston,L et al.Cloning,heterologous expression,and functional characterization of 5-epi-aristolochene -1,3-dihydroxylase fron tobacco(Nicotiana tabacun).Arch.Biochen B10phy393.222--2362001). [21]Wang.E.et al.Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichoneglands enhances natural-product based aphid resistance.Nature Biotechnol.19.371--374 (2001). [22]Elnarakby.S.A.,El-Feraly,F.S..Elsohly,H.N.,Croom,E.M.Bafford.C. D.Microbiological transformations of artemisinic acid.Phytochemistry 27.3089--3091 (1988). [23]Kin.S..Han,J.Lin.Y.Revised assignrent of IH-NMR sigals of artemisinicacid.Planta 4ed.62,480--481(1996). [24]Helliwell.C.A.,Poole,A.,Peacock.W.J.Dennis,E.S.Arabidopsisent-kaurene oxidase catalyzes three steps of gibberellin biosynthesis.PlantPhysiol.119.507--510 (1999). 10
微生物发酵工程案例教学 10 Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 63, 3341–-3344 [13] Gardner, R. G. & Hampton, R. Y. A highly conserved signal controls degradation of 3-hydroxy-3-methylglut aryl-coenzyme A (HMG-CoA)reductase in eukaryotes. J. Biol. Chem. 274, 31671–-31678 (1999). 1[4.]Davies, B. S. J., Wang, H. S. & Rine, J. Dual activators of the sterol biosynthetic pathway of Saccharomyces cerevisiae: Similar activation/regulatory domains but different response mechanisms. Mol. Cell. Biol. 25, 7375–-7385 (2005). [15]Jackson, B. E., Hart-Wells, E. A. & Matsuda, S. P. T. Metabolic engineering to produce sesquiterpenes in yeast. Org. Lett. 5, 1629–-1632 (2003). [16] Seaman, F. C. Sesquiterpene lactones as taxonomic characters in the Asteraceae. Bot. Rev. 48, 121–-592 (1982). [17]Bertea, C. M. et al. Identification of intermediates and enzymes involved in the early steps of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua. Planta Med. 71,40–-47 (2005). [18] Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. Basic localalignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403–-410 (1990). [19] Lupien, S., Karp, F., Wildung, M. & Croteau, R. Regiospecific cytochrome P450limonene hydroxylases from mint (Mentha) species: cDNA isolation,characterization, and functional expression of (2)-4S-limonene-3-hyd roxylase and (2)-4S-limonene-6-hydroxylase. Arch. Biochem. Biophys. 368, 181–-192(1999). [20]Ralston, L. et al. Cloning, heterologous expression, and functional characterization of 5-epi-aristolochene -1, 3- dihydroxylase from tobacco(Nicotiana tabacum). Arch. Biochem. Biophys. 393, 222–-235 (2001). [21] Wang, E. et al. Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichomeglands enhances natural-product - based aphid resistance. Nature Biotechnol. 19,371–-374 (2001). [22] Elmarakby, S. A., El-Feraly, F. S., Elsohly, H. N., Croom, E. M. & Hufford, C. D.Microbiological transformations of artemisinic acid. Phytochemistry 27,3089–-3091 (1988). [23]Kim, S., Han, J. & Lim, Y. Revised assignment of 1H-NMR signals of artemisinicacid. Planta Med. 62, 480–-481 (1996). [24] Helliwell, C. A., Poole, A., Peacock, W. J. & Dennis, E. S. Arabidopsisent-kaurene oxidase catalyzes three steps of gibberellin biosynthesis. PlantPhysiol. 119, 507–-510 (1999)