南开大学案例梭状芽孢杆菌特异性PCR引物在产氢细菌群落的暗发酵分析中的应用_微生物发酵工程.doc_大学文库

梭状芽孢杆菌特异性PR引物在产氢细菌群落的暗发酵分析中的应用 Chun-Hsiung Hung',Chin-Hung Cheng',Lu-Hsiu Cheng',Chi-Ming Liang',Chiu-Yue Lin' ·台湾台中市国立中兴大学环境工程系 “台湾台中市逢甲大学环境技术与科学系关键词：发酵法氢生产，梭状芽孢杆菌，引物，细菌群落结构，PCR 摘要：像利用普遍的16 S rDNA PCR引物组的PCR-DGGE的分子生物学手段常常用于梭状芽孢杆菌属细南群落的研究。可是由于共存的梭状芽孢杆菌属与其他厌氧微生物很难分辨，经常获得不满意的结果。这次研究中的特异PCR引物组基于数据库里的rRNA基因序列，只把多数的ClustersI和II作为目标，梭状芽孢杆菌属是在纯培养和暗发酵污泥两者设计及检验的。己证明了这新的引物组不仅成功地区分共存的梭状芽孢杆菌种类而且还能显示出一些使用普遍引物组所不能发现的梭状芽孢杆菌种类的存在。此方法在暗发酵系统中提供了有效产氢梭状芽孢杆菌属群落的详细的可视性。引言：与从热化学和电化学生产相比，通过各种生物过程生产氢气对生态保护更加有利。暗发酵中氢是被厌氧细菌从有机化合物生产的，具有很高的电势成为了可行的生物制氢系统，因为它的2产率比其他生物学方法高得多。Lvin等人提出了在暗发酵中更进一步研究应该要把目标放在通过迅速的移去气体的净化和基因修改，以增加合成速率与2的最终产量。产氢相关酶的基因改造面临着巨大的挑战，因为氢的产出代表在细胞的能量损失并新陈代谢网络向能量使用的合理化与特定生长率的最优化发展。因此对没有基因操作从环境样品中浓缩的产氢微生物群落生态学彻底的了解是在揭示效率和稳定性相关的因子与展开改善发酵过程的战略中是必须的。不同的产氢黑暗发酵系统的微生物都被各种各样的分子生物学方法研究了，包括 PCR-DGGE、克隆文库和RT-PCR。即使在展开产氢暗发酵过程梭状芽孢杆茵类的成分中确定了主要种，在细菌群落的组成上由于共存的梭状芽孢杆菌与其他厌氧菌的区分是很难，因此也经常得到不满意的结果。有超过80种的梭状芽孢杆菌属根据16SDN系统发育分析被识别了。经常被识别的产氢梭状芽孢杆菌属如巴氏梭状芽孢杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌和丙酮丁醇梭状芽孢杆菌都被发现分类到最大的梭状芽孢杆茵子群-梭状芽孢杆菌属的ClusterI。这个ClusterI子群不仅包含半数以上的梭状芽孢杆菌属而且含有很高的16 S rRNA相似性使得使用普遍的引物组968f-1392r区分变得很难。因此此项研究把目标放在了开发针对于梭状芽孢杆菌属更多的可变区序列的新PCR引物组。来自几个暗发酵制氢系统的Sludge阳样品使用 968f-1392r引物和新的引物组研究了细菌组成比较结果。这新引物组的PCR扩增参数以及其在梭状芽孢杆菌属的纯培养物的应用也被证明了

梭状芽孢杆菌特异性 PCR 引物在产氢细菌群落的暗发酵分析中的应用 Chun-Hsiung Hunga，Chin-Hung Chenga，Lu-Hsiu Chenga，Chi-Ming Lianga，Chiu-Yue Linb a 台湾台中市国立中兴大学环境工程系 b 台湾台中市逢甲大学环境技术与科学系关键词：发酵法氢生产，梭状芽孢杆菌，引物，细菌群落结构，PCR 摘要：像利用普遍的 16S rDNA PCR 引物组的 PCR-DGGE 的分子生物学手段常常用于梭状芽孢杆菌属细菌群落的研究。可是由于共存的梭状芽孢杆菌属与其他厌氧微生物很难分辨，经常获得不满意的结果。这次研究中的特异 PCR 引物组基于数据库里的 rRNA 基因序列，只把多数的 ClustersI 和 II 作为目标，梭状芽孢杆菌属是在纯培养和暗发酵污泥两者设计及检验的。已证明了这新的引物组不仅成功地区分共存的梭状芽孢杆菌种类而且还能显示出一些使用普遍引物组所不能发现的梭状芽孢杆菌种类的存在。此方法在暗发酵系统中提供了有效产氢梭状芽孢杆菌属群落的详细的可视性。引言：与从热化学和电化学生产相比，通过各种生物过程生产氢气对生态保护更加有利。暗发酵中氢是被厌氧细菌从有机化合物生产的，具有很高的电势成为了可行的生物制氢系统，因为它的 H2 产率比其他生物学方法高得多。Levin 等人提出了在暗发酵中更进一步研究应该要把目标放在通过迅速的移去气体的净化和基因修改，以增加合成速率与 H2 的最终产量。产氢相关酶的基因改造面临着巨大的挑战，因为氢的产出代表在细胞的能量损失并新陈代谢网络向能量使用的合理化与特定生长率的最优化发展。因此对没有基因操作从环境样品中浓缩的产氢微生物群落生态学彻底的了解是在揭示效率和稳定性相关的因子与展开改善发酵过程的战略中是必须的。不同的产氢黑暗发酵系统的微生物都被各种各样的分子生物学方法研究了，包括 PCR-DGGE、克隆文库和 RT-PCR。即使在展开产氢暗发酵过程梭状芽孢杆菌类的成分中确定了主要种，在细菌群落的组成上由于共存的梭状芽孢杆菌与其他厌氧菌的区分是很难，因此也经常得到不满意的结果。有超过 80 种的梭状芽孢杆菌属根据 16SrDNA 系统发育分析被识别了。经常被识别的产氢梭状芽孢杆菌属如巴氏梭状芽孢杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌和丙酮丁醇梭状芽孢杆菌都被发现分类到最大的梭状芽孢杆菌子群-梭状芽孢杆菌属的 ClusterI。这个 ClusterI 子群不仅包含半数以上的梭状芽孢杆菌属而且含有很高的 16S rRNA 相似性使得使用普遍的引物组 968f-1392r 区分变得很难。因此此项研究把目标放在了开发针对于梭状芽孢杆菌属更多的可变区序列的新 PCR 引物组。来自几个暗发酵制氢系统的 Sludge 样品使用 968f-1392r 引物和新的引物组研究了细菌组成比较结果。这新引物组的 PCR 扩增参数以及其在梭状芽孢杆菌属的纯培养物的应用也被证明了

2.材料与方法 2.1产氢S1udg©与梭状物杆菌的纯培养暗发酵产氢S1e是从两个木糖补料连线授并厌氧生物反应器而米的，是分别加了硅阴凝歌取固定细脑和作为载体的粉来状的活性炭，四个纯培养物，C,pasteurianum CHBT-l,C.butyricu■FC-2,Clostridiun ©seu面C≤-l与C.butyricun CG2是从不同的暗发酵系统分离出米的，也是从前工作透作为检验引物设计。 2.2引物选葬与设计两个PCR引物用于细菌16SrN黑的扩增.为了全面的细菌群落的组成，上游引物EE968f携带了GC Clap,下游引物使用了n1ver1392r,Prc中ase数据库利用于设计枝状芽形杆菌特异引物组。两个深针组序列Ghis150和C10st核确定并分配于引物序列。表一概述出此项研究中所使用的CR引物序列。 2.316 S rDNA的扩增与鉴定适当量的S1dge样品与梭状对泡杆商纯培养物在收集萃取之前立即冻存于-20℃，为了草取基因组N4被冻的样品先差化分散.然后以1X磷酸援冲盐PS洗了两次，BS的成分是aC18,0g/L,C10,2/L. 品HP01.15g/L和HP00.2g/L.细胞先于10000离心2ain进行浓缩。整个基因组D获得之后按照厂家说明书使用Blood&Tissue Gencaic DNA Extraction Miniprep System(Viogene,Taiwan)进行净化， N样品CR之前存于-20℃。R体系(50L)有浓度为200=W的dNTP。1.5N的MgC1a.浓度为0,2N的各种引物，1,250的Taq解(Promega,ladision,T)和CR buffer,扩增包括95C3ain的预变性。之后35个幅环中95℃45s的变性，45s的退火包括分别进行51℃的968gc-1392r引物组退火和57℃的 is150f-C1ostr引物组的退火，72℃2n的廷伸。循环为了保狂产物的定全延伸还包括了72℃3a1n的最后延伸反应.所有PCR反应都是在automatic thermal cycleriCycler国(Bio-Rad,Los Angeles.CA) 下选行的。在1，群的障脂糖凝政上100W进行30mn电袜检验C3产物。B染色之后扩增产物可以在紫外线下可见 2.4DGG健与系统发育分析 PCR扩增NA是使用基因突变分析系统(BioRad,.SA)根据yzer等人的CCE方法下获得的。的丙烯酰胶溶液用于投到凝取，并分别给S68gc-1392r引物组和Chis150f-C1 ostIr引物组从0m到65群与从30%到60%梯度排列了变性剂.电冰在1*TAEbuffer80W60℃下进行了12个小时，凝胶用SYE假Green I (resco,.SA)染色了10阳in并可在紫外线下观察。运算分类学单位(0Us)的数字在同样样品中定义为GGE的条带数.在凝胶中选出GE条带并切下来放到1.5al管，经过3次的冰冻(-80℃》与雕化(60℃) 处理之后国收NA,为了保证回收的NA纯度进行了附如零-DCC距分析，目的NA序列的分析与同题探素是使用标准DNA测序载件(1 ssion Biotec由。Taivan)与米白Biolo灯ork bench

2.材料与方法 2.1 产氢 Sludge 与梭状芽孢杆菌的纯培养暗发酵产氢 Sludge 是从两个木糖补料连续搅拌厌氧生物反应器而来的，是分别加了硅酮凝胶固定细胞和作为载体的粉末状的活性炭。四个纯培养物，C. pasteurianum CHBT-1，C. butyricum CHFC-2，Clostridium roseum CHRS-1 与 C. butyricum CGS2 是从不同的暗发酵系统分离出来的，也是从前工作选作为检验引物设计。 2.2 引物选择与设计两个 PCR 引物用于细菌 16S rDNA 的扩增。为了全面的细菌群落的组成，上游引物 EUB968f 携带了 GC Clamp，下游引物使用了 Univer1392r。Probebase 数据库利用于设计梭状芽孢杆菌特异引物组。两个探针组序列 Chis150 和 ClostI 被确定并分配于引物序列。表一概述出此项研究中所使用的 PCR 引物序列。 2.3 16S rDNA 的扩增与鉴定适当量的 Sludge 样品与梭状芽孢杆菌纯培养物在收集 DNA 萃取之前立即冻存于-20℃。为了萃取基因组 DNA 被冻的样品先融化分散，然后以 1X 磷酸缓冲盐 PBS 洗了两次，PBS 的成分是 NaCl 8.0g/L，KCl 0.2g/L， Na2HPO4 1.15g/L 和 KH2PO4 0.2g/L。细胞先于 10000g 离心 2min 进行浓缩。整个基因组 DNA 获得之后按照厂家说明书使用 Blood & Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System（Viogene，Taiwan）进行净化。 DNA 样品 PCR 之前存于-20℃。PCR 体系（50mL）有浓度为 200mM 的 dNTP，1.5mM 的 MgCl2，浓度为 0.2mM 的各种引物，1.25U 的 Taq 酶（Promega，Madision，WI）和 PCR buffer。扩增包括 95℃3min 的预变性，之后 35 个循环中 95℃45s 的变性，45s 的退火包括分别进行 54℃的 968gc-1392r 引物组退火和 57℃的 Chis150f-ClostIr 引物组的退火，72℃2min 的延伸。循环为了保证产物的完全延伸还包括了 72℃3min 的最后延伸反应。所有 PCR 反应都是在 automatic thermal cycleriCyclerTM (Bio-Rad, Los Angeles, CA) 下进行的。在 1.5%的琼脂糖凝胶上 100V 进行 30min 电泳检验 PCR 产物。EB 染色之后扩增产物可以在紫外线下可见。 2.4 DGGE 与系统发育分析 PCR 扩增 DNA 是使用基因突变分析系统（BioRad，USA）根据 Muyzer 等人的 DGGE 方法下获得的。6%的丙烯酰胺溶液用于投放到凝胶，并分别给 968gc-1392r 引物组和 Chis150f-ClostIr 引物组从 40%到 65%与从 30%到 60%梯度排列了变性剂。电泳在 1*TAEbuffer 80V60℃下进行了 12 个小时。凝胶用 SYBR Green I （Amresco，USA）染色了 10min 并可在紫外线下观察。运算分类学单位（OTUs）的数字在同样样品中定义为 DGGE 的条带数。在凝胶中选出 DGGE 条带并切下来放到 1.5ml 管，经过 3 次的冰冻（-80℃）与融化（60℃）处理之后回收 DNA。为了保证回收的 DNA 纯度进行了附加 PCR-DGGE 分析。目的 DNA 序列的分析与同源性探索是使用标准 DNA 测序软件（Mission Biotech，Taiwan）与来自 Biology Work bench

境微生物，根据细商M基因的现代分子生物学方法在细菌组成的确定上很流行，几个研究利用16⑧XA 吸GE方法很成功的识别了不同品生产反应器里所可能的产氢微生物。不过这些方法在混合细商组成遇到了困难。改善这些不满意的结果的一种可行的方法是通过实践的目标微生物特异性检测方法，如采用特异性引物测试。 3.2使用普薄的和搜状孢杆菌特异性的引物组在产氢S1udg©上FCGE分析使用CR-GE方法的细菌群落分析是根据代R扩增的同样长度的特异基因的片段的分开。不同微生物群落的©E分析证实了分离模式下区分条带的出观。这些条带最有可能是由组成种那的多个不列种属而米的，因此产生了该群落的GE结果。此项研究中几个S1dg样品是从两个产氢暗发解反应器中分离出米的。袍化的NM样品进行了C果-CE分析，是使用以真细商16SrM为目标模版的携带GC-℃l即的 68F与N1V13928引物的。主要条带中的NA技纯化，再扩增，测序以确定它的身份。图2(A)显示来自两个不同S1udg©样品的微生物的全面餐况.除了有两条不明的条带之外，51dc的细商群落结构被发现以C.pasteurianum,C.butyricun.Klebsiella pneumoniae,Dialister,.nd Bifidobacterium等为主要成分组成的。代表檀状芽孢杆菌的两个特异条带都重叠难以分辨。在不日变性凝乾浓度草围肉清行的回样的实的没有改善条带的分离(d由a0tshm),显然，并满的引物组没有足够显示详细的产氢登生物。图2(B》最示改川梭状穿施杆茵属特异引物组口 l5Of-ClostIr米扩增的同样的s1ude样品做的PCR-DGCE, 尽管使用警避明物也能简单的初步确老一成两个不月种属存在于S1d样品，国使用特异引物组透过实际存在的6个和5个条替也能分别揭示在这些两个S1ud聊样品里存在枝状芽孢杆菌。图2(B)为与larker比较的结果。C,steurianum与C.butyricum都存在于样品中并在测试样品中存在5个不明身份的额外条带。这些不明条替进一步分离之后进行测序其结果显示在表2，发现不明条带的Nol3都与C.butyricun HA-K1具有很高的相似性（数据号A604563)多条的这些四个序列显示在510 个碱基对的目标区域之外只有5个错配，这些99，销的识别相似性可能指示着所有这线序列是来白一个带有多考贝16SrNA的单种的C.butyriciun。条带o5被认为未知的搜状芽孢杆菌属。总之，就如我们预言这些新的州物组应围示更多详细的皮状芽孤杆菌群园条带Mo4是识别为C.tyrob如tyr1eium,是在普遍引物组没有显示的。 2 Purified DGGE band sequence analysis and comparison Band Sequence Identif Acceasio 0 rganis短8ff11 fation n0. 1 ength(bp】 T() n no. 1 Clostridiun butyricun HAN-HCI 471 98 AY604563 2 Clostridiun butyricun HAW-BCI 472 99 AY604563

境微生物。根据细菌 rRNA 基因的现代分子生物学方法在细菌组成的确定上很流行。几个研究利用 16S rRNA PCR-DGGE 方法很成功的识别了不同 H2 生产反应器里所可能的产氢微生物。不过这些方法在混合细菌组成遇到了困难。改善这些不满意的结果的一种可行的方法是通过实践的目标微生物特异性检测方法，如采用特异性引物测试。 3.2 使用普遍的和梭状芽孢杆菌特异性的引物组在产氢 Sludge 上 PCR-DGGE 分析使用 PCR-DGGE 方法的细菌群落分析是根据 PCR 扩增的同样长度的特异基因的片段的分开。不同微生物群落的 DGGE 分析证实了分离模式下区分条带的出现。这些条带最有可能是由组成种群的多个不同种属而来的，因此产生了该群落的 DGGE 结果。此项研究中几个 SludgeDNA 样品是从两个产氢暗发酵反应器中分离出来的。纯化的 DNA 样品进行了 PCR-DGGE 分析,是使用以真细菌 16S rDNA 为目标模版的携带 GC-clamp 的 EUB968F 与 UNIV1392R 引物的。主要条带中的 DNA 被纯化，再扩增，测序以确定它的身份。图 2（A）显示来自两个不同 Sludge 样品的微生物的全面概况。除了有两条不明的条带之外，Sludge 的细菌群落结构被发现以 C. pasteurianum,C. butyricum, Klebsiella pneumoniae, Dialister,and Bifidobacterium 等为主要成分组成的。代表梭状芽孢杆菌的两个特异条带都重叠难以分辨。在不同变性凝胶浓度范围内进行的同样的实验没有改善条带的分离（data not shown）。显然，普遍的引物组没有足够显示详细的产氢微生物。图2（B）显示改用梭状芽孢杆菌属特异引物组Chis150f-ClostIr来扩增的同样的Sludge样品做的PCR-DGGE。尽管使用普遍引物也能简单的初步确定一或两个不同种属存在于 Sludge 样品，但使用特异引物组通过实际存在的 6 个和 5 个条带也能分别揭示在这些两个 Sludge 样品里存在梭状芽孢杆菌。图 2（B）为与 Marker 比较的结果。C. pasteurianum 与 C. butyricum 都存在于样品中并在测试样品中存在 5 个不明身份的额外条带。这些不明条带进一步分离之后进行测序其结果显示在表 2。发现不明条带的 No1~3 都与 C. butyricum HAW-HC1 具有很高的相似性(数据号 AY604563)多条的这些四个序列显示在 540 个碱基对的目标区域之外只有 5 个错配。这些 99.6%的识别相似性可能指示着所有这些序列是来自一个带有多拷贝 16S rDNA 的单种的 C.butyricium。条带 No5 被认为未知的梭状芽孢杆菌属。总之，就如我们预言这些新的引物组应揭示更多详细的梭状芽孢杆菌群落，条带 No4 是识别为 C.tyrobutyricium，是在普遍引物组没有显示的。表2PPurified DGGE band sequence analysis and comparison Band no. Organism affiliation Sequence length (bp) Identif y(%) Accessio n no. 1 Clostridium butyricum HAW-HCl 471 98 AY604563 2 Clostridium butyricum HAW-HCl 472 99 AY604563

3 Clostridiun butyricun HAW-BCI 460 99 AY60M563 Clostridium tyrobutyricum 406 96 L08062 Unculture Clostridiun sp. 372 95 9168831 Clone Previously unidentified DGGE bands as revealed in Fig.2. 3.3使用特异引物组的校状芽孢杆菌纯培养物的FCRC远分析校状芽孢杆衡属的三个纯培养物-C.pasteurianun CHBT-l,Cb闻tyricun CHFC-2.and C.roseun s-1是与前研究无关的，是为检测特异引物组选择的。如图3最示在C.pasteurianum和C.roseun的两个纯培养物发现只有一条清晰的条带，而C.butyricun CHPC-2有四个清晰的条带。这也有可能是在混合培养的Sludge样品中按识别的C.butyricun DGGE条带不止一个的原因。除了C.butyricun CHFC-2,两个C,butyr1Cum纯培养物CHF-1与CGS2也为验证多条带核选择了。如图3显示，不同DGE条带确定了这些三个商株，尽管C.butyricun CHPC-2与C.butyr1 cun CGS2都带有四个DGGE条带但还是不一致，而C butyricum CHFC-1只有一个GGE条带。这个特殊的条带位置有可能是所有C.如tyricu的标记，因为所有三个测试菌株都带有这条带。为了证实这线两个引物组之间的显著性差异，从基因数暴岸中下载4个不同C加tyriciun的16S 序列并使用多重对比检测进行了分析。如图4显示普追引物组目标区线之内，即位置986-139迎之内，具发现了两个次要的不同位置的碱基配对。这与R-DCGE结果很符合，并说明了为什么968-1392引物组来区分校状霁德杆南属失败的。另一方面150-0序列之内确定了主要存在总共6个变化的序列，这使得代闲引物组的新组合能够区分高度相似的梭状芽孢杆菌属.已报道C.butyriciu■的基因组内具有高达10个将明的16sr冰A,这也可能是如回此研究中证实不国C.hutyr1c■她培养物L有标记性的E条带形式的星因。因此使用这代特吊性引物组的另一个大的利性之处在于适过这线心E条带形式隆够区分 .butyricium不同菌株，使用众多所知的普追引物超968f-193r的CR-GGE实验结果明确表示暗发醇产氢S1ud里还存在搜状芽孢杆商之外的微生物。这让很难理解共存的微生物的作用，如1 ebsiella,.Dialister, Bifidobacterium。本实验证实，使用普考引物组的CR-GG证分析提供了全面的多样性和产氢细菌群落结构的变化方面的信息并且有用于群落之间的区分与数字上确定主要群落成员的初步酥究。不过使用搜装芽孢杆菌特异引物姐的R-E分析在区分产氢檀状芽孢杆商亲锋关系的主要概况与产氢中的实际差异方面成为了有用的工具。生物产氢发酵设计的优化之外Yi等人也提出了暗发酵中的进一步研究中应把目标放在微生物，因

3 Clostridium butyricum HAW-HCl 460 99 AY604563 4 Clostridium tyrobutyricum 406 96 L08062 5 Unculture Clostridium sp. Clone 372 95 DQ168831 Previously unidentified DGGE bands as revealed in Fig. 2. 3.3 使用特异引物组的梭状芽孢杆菌纯培养物的 PCR-DGGE 分析梭状芽孢杆菌属的三个纯培养物-C. pasteurianum CHBT-1,C. butyricum CHFC-2, and C. roseum CHRS-1 是与前研究无关的，是为检测特异引物组选择的。如图 3 显示在 C.pasteurianum 和 C.roseum 的两个纯培养物发现只有一条清晰的条带，而 C. butyricum CHFC-2 有四个清晰的条带。这也有可能是在混合培养的 Sludge 样品中被识别的 C. butyricum DGGE 条带不止一个的原因。除了 C. butyricum CHFC-2, 两个 C. butyricum 纯培养物 CHFC-1 与 CGS2 也为验证多条带被选择了。如图 3 显示，不同 DGGE 条带确定了这些三个菌株。尽管 C.butyricum CHFC-2 与 C.butyricum CGS2 都带有四个 DGGE 条带但还是不一致，而 C. butyricum CHFC-1 只有一个 DGGE 条带。这个特殊的条带位置有可能是所有 C.butyricum 的标记，因为所有三个测试菌株都带有这条带。为了证实这些两个引物组之间的显著性差异，从基因数据库中下载 4 个不同 C.butyricium 的 16S rDNA 序列并使用多重对比检测进行了分析。如图 4 显示普遍引物组目标区域之内，即位置 986-1392 之内，只发现了两个次要的不同位置的碱基配对。这与 PCR-DGGE 结果很符合，并说明了为什么 968-1392 引物组来区分梭状芽孢杆菌属失败的。另一方面 150-690 序列之内确定了主要存在总共 6 个变化的序列，这使得 PCR 引物组的新组合能够区分高度相似的梭状芽孢杆菌属。已报道 C.butyricium 的基因组内具有高达 10 个拷贝的 16S rDNA。这也可能是如同此研究中证实不同 C.butyricium 纯培养物具有标记性的 DGGE 条带形式的原因。因此使用这些特异性引物组的另一个大的利益之处在于通过这些 DGGE 条带形式能够区分 C.butyricium 不同菌株。使用众多所知的普遍引物组 968f-1393r 的 PCR-DGGE 实验结果明确表示暗发酵产氢 Sludge 里还存在梭状芽孢杆菌之外的微生物。这让很难理解共存的微生物的作用，如 Klebsiella，Dialister， Bifidobacterium。本实验证实，使用普遍引物组的 PCR-DGGE 分析提供了全面的多样性和产氢细菌群落结构的变化方面的信息并且有用于群落之间的区分与数字上确定主要群落成员的初步研究。不过使用梭装芽孢杆菌特异引物组的PCR-DGGE分析在区分产氢梭状芽孢杆菌亲缘关系的主要概况与产氢中的实际差异方面成为了有用的工具。生物产氢发酵设计的优化之外 Levin 等人也提出了暗发酵中的进一步研究中应把目标放在微生物。因

此对没有基因操作从环境样品中浓缩的产氢微生物群落生老学底的了解是在揭示效幸和稳定性相关的因子与展开改善发酵过程的战略中是必筑的。使用此研究中开发的这些特异性引物组。工程师们可以首次在反应器中实时的密切关注产氢枝状芽雅杆南的存在，然后可以设计有效的产氢战略。 4结论此研究中，特异引物组(his150f-C1 ostIr)是根据数据库里的rA基因序列的。只针对于梭状芽泡杆商的主要C1 asterI和Ⅱ而设计的。并在梭状芽微杆商的纯培养物与暗发醇Sludze中进行了测验。此研究证实了这些新的引物组不仅成功地区分共存的梭状芽孢杆菌菌种面且拥示了使用普游引物组所发现不了的一些搜状芽孢杆菌种的存在。使用鲁墙引物相的CG逐分析可服务于初步研究，并可提供产氢细商群落结构上的多样性信息，不过，使用这特异引物组C像-E分析出现成为了辨别主要产氢校状芽型杆面种屏以及愎状芽孢杆鞠纯培养物的亲锋关系的更有效的方法。总之这方法提供了在生物产氯暗发解系统中搜状芽孢杆菌群落的详细的可视监测，因为这些微生物必须有效的进行产氢。致谢作者非常够谢能源具的财政支持《Grant nos:9-0137-2)。作者感谢国立成功大学的张教授与赵妹提供了Clostridiun butyricium CGS2的纯培养物. Reference [1]Das D,Veziroglu TN.Hydrogen production by biological processes:a survey of literature. Int J Hydrogen Energy 2001:26(1)13-28. [2]Levin DB.Pitt L,Love M.Biohydrogen production:prospects and limitations to practical application.Int J Hydrogen Energy 2004:29(2)173-85. [3]Vignais PM.Magnin J-P,Willison JC.Increasing biohydrogen production by petabolic engineering.Int J Hydrogen Energy 2006:31(11):1478-83. [4]Ahn Y,Park E-J.Ch Y-K,Park S.Webster G.Weightman AJ.Biola nicrobial comunity of a thermophilie trickling bionlter used for comtinuous biohydrogen production.FEVS Microbiol Lett 2005:249(1):31-8. [5]Kawagoshi Y,Hino N.Fujinoto A.Nakao M.Fujita Y,Sugimura S,et al.Effect of inoculun conditioning on hydrogen fermentation and pl effect on hacterial community relevant to hydrogen production.J Biosei Bioeng 2005:100(5):524 -30. [6]Nu S-Y,Hung C-H.Lin C-N,Chen H-W,Lee A-S,Chang J-S.Fermentative hydrogen production and bacterial community structure in high-rate anaerobic bioreactors containing silicone-immobilized and self-flocculated sludge.Biotechnol Bioeng 2006:93(5):934-46

此对没有基因操作从环境样品中浓缩的产氢微生物群落生态学彻底的了解是在揭示效率和稳定性相关的因子与展开改善发酵过程的战略中是必须的。使用此研究中开发的这些特异性引物组，工程师们可以首次在反应器中实时的密切关注产氢梭状芽孢杆菌的存在，然后可以设计有效的产氢战略。 4.结论此研究中，特异引物组（Chis150f-ClostIr）是根据数据库里的 rRNA 基因序列的，只针对于梭状芽孢杆菌的主要 ClusterI 和 II 而设计的，并在梭状芽孢杆菌的纯培养物与暗发酵 Sludge 中进行了测验。此研究证实了这些新的引物组不仅成功地区分共存的梭状芽孢杆菌菌种而且揭示了使用普遍引物组所发现不了的一些梭状芽孢杆菌种的存在。使用普遍引物组的 PCR-DGGE 分析可服务于初步研究，并可提供产氢细菌群落结构上的多样性信息。不过，使用这特异引物组 PCR-DGGE 分析出现成为了辨别主要产氢梭状芽孢杆菌种群以及梭状芽孢杆菌纯培养物的亲缘关系的更有效的方法。总之这方法提供了在生物产氢暗发酵系统中梭状芽孢杆菌群落的详细的可视监测，因为这些微生物必须有效的进行产氢。致谢作者非常感谢能源局的财政支持（Grant nos. 94-D0137-2）。作者感谢国立成功大学的张教授与赵姝提供了 Clostridium butyricium CGS2 的纯培养物。 Reference [1] Das D, Veziroglu TN. Hydrogen production by biological processes: a survey of literature. Int J Hydrogen Energy 2001;26(1):13–28. [2] Levin DB, Pitt L, Love M. Biohydrogen production: prospects and limitations to practical application. Int J Hydrogen Energy 2004;29(2):173–85. [3] Vignais PM, Magnin J-P, Willison JC. Increasing biohydrogen production by metabolic engineering. Int J Hydrogen Energy 2006;31(11):1478–83. [4] Ahn Y, Park E-J, Oh Y-K, Park S, Webster G, Weightman AJ. Biofilm microbial community of a thermophilic trickling biofilter used for continuous biohydrogen production. FEMS Microbiol Lett 2005;249(1):31–8. [5] Kawagoshi Y, Hino N, Fujimoto A, Nakao M, Fujita Y, Sugimura S, et al. Effect of inoculum conditioning on hydrogen fermentation and pH effect on bacterial community relevant to hydrogen production. J Biosci Bioeng 2005;100(5):524–30. [6] Wu S-Y, Hung C-H, Lin C-N, Chen H-W, Lee A-S, Chang J-S.Fermentative hydrogen production and bacterial community structure in high-rate anaerobic bioreactors containing silicone-immobilized and self-flocculated sludge. Biotechnol Bioeng 2006;93(5):934–46

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南开大学 案例 梭状芽孢杆菌特异性PCR引物在产氢细菌群落的暗发酵分析中的应用_微生物发酵工程

南开大学案例梭状芽孢杆菌特异性PCR引物在产氢细菌群落的暗发酵分析中的应用_微生物发酵工程