南开大学案例培养条件决定由戊糖乳杆菌LPS26生产的两种外多糖的平衡_微生物发酵工程.doc_大学文库

培养条件决定由戊糖乳杆商L26生产的两种外多糖的平衡 Jorge-Igmnacio Sa'nchez,'Beatriz Martr'nex,'Rafael Guille'n, Rutino Jime'nez-Or'az,and Ana Rodr'guez' Instituto de Productos La'cteos de Asturias (IPLA-CSIC).Ctra.Infiesto s/n.33300 Villaviciosa.Spain,'and Instituto de la Grasa (IG-CSIC),Departanento de Biotecnologr'a de Alimentos,Apartado 1078,41012 Seville,Spain' Received 10 May 2006/Accepted 19 Septemher 2006 从绿嫩棱自然发醇物中分离得到的戊糖乳杆商PS26,可以生产一类由两种图外多糖(S)组成的英膜多聚物：PSA,一种高分子量园外多糖，由葡阁糖和佩李糖(3：1)组成：EPSB,一种低分子量(33×10) 胞外多糖，由葡萄糖和甘露糖(3：1)组成。通过使用不同碳源（葡阁糖、果糖、甘露醇和乳糖）的化学半限定培养基发酵试验表明除了果糖之外其它碳激都更有利于SA的生产，温度和用的影响进行了更进一步的分析，面着温度的降低，可以检测到两种ES的合成都有提高。州的调节更增强了5B的生产。考虑到这些，在不最适宜的生长温度(20℃)，属.0的情况下可以达到的最大产量(514/L),连铁培养表明主要在低稀释度合成的5A很明显地依翰于生长速率，而5B的合成几孕不受影响。再补加脱脂乳后的生产也可被检测到，但没有关于发酵牛奶粘性增加的报道。这与在这种条件下低分子量多糖高比例生产有关，与在培养基中观察到的结果形成对弧。总之。现阶段的研究表明培养基的条件对于由菌株L5生产的5的类型和浓度有很明显的影响，因此，这些条件应进行认真桃选以用于优化和应用研究。最后，应该指出的是，这是据我们所知的第一篇关于由戊糖乳杆菌产S的报道。前言微生物围外多糖(S》是一类范围广泛的分泌多聚物。既可以紧密连接在细围表面（英膜多糖），也可以胞外多粘物顺分漫到胞外圆。在自然环境中，多糖与毒力和细胞抗干燥，漆透压、抗生素、毒性物质以及抗菌素或原生动物的政击有关，切。众所周知。这些分子以作为乳化剂、刺度剂、粘度计和稳定剂应用于食品方面。在由细茵产的PS中，那些由乳酸细南(AB)生产的引起了人们越来越多的兴趣，因为这些产品是“食品级”的。由LB生产的西的流变性质已主要应用于发解乳制品生产制造业，例如酸奶格、干酪以及发醇牛奶等方面，而且在肉类发酵和果蔬发醇的精细如工方面也由重要作用性数丝一，另外，它门也己被证明对人体望康丰常有益。例如降低阻固丽、抗癌、免疫活性以及发育等方面的影响甲。一些研究表明LB产S对于在乳制品工业中非常严重的噬衡体8染由部分抗性 B生产的5可以由一种糖单体构成（同聚多糖），也可以由几种单体构成（桑多糖）。而且，由不

1 培养条件决定由戊糖乳杆菌 LPS26 生产的两种外多糖的平衡 Jorge-Ignacio Sa´nchez,1 Beatriz Martı´nez,1 Rafael Guille´n,2 Rufino Jime´nez-Dı´az,2 and Ana Rodrı´guez1 * Instituto de Productos La´cteos de Asturias (IPLA-CSIC), Ctra. Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa, Spain,1 and Instituto de la Grasa (IG-CSIC), Departamento de Biotecnologı´a de Alimentos, Apartado 1078, 41012 Seville, Spain2 Received 10 May 2006/Accepted 19 September 2006 从绿橄榄自然发酵物中分离得到的戊糖乳杆菌 LPS26，可以生产一类由两种胞外多糖(EPS)组成的荚膜多聚物：EPS A，一种高分子量胞外多糖，由葡萄糖和鼠李糖（3：1）组成；EPS B，一种低分子量（3.3×104）胞外多糖，由葡萄糖和甘露糖（3：1）组成。通过使用不同碳源（葡萄糖、果糖、甘露醇和乳糖）的化学半限定培养基发酵试验表明除了果糖之外其它碳源都更有利于 EPS A 的生产。温度和 pH 的影响进行了更进一步的分析。随着温度的降低，可以检测到两种 EPS 的合成都有提高。pH 的调节更增强了 EPS B 的生产。考虑到这些，在不最适宜的生长温度（20℃）、pH6.0 的情况下可以达到 EPS 的最大产量（514mg/L）。连续培养表明主要在低稀释度合成的 EPS A 很明显地依赖于生长速率，而 EPS B 的合成几乎不受影响。再补加脱脂乳后 EPS 的生产也可被检测到，但没有关于发酵牛奶粘性增加的报道。这与在这种条件下低分子量多糖高比例生产有关，与在培养基中观察到的结果形成对照。总之，现阶段的研究表明培养基的条件对于由菌株 LPS26 生产的 EPS 的类型和浓度有很明显的影响，因此，这些条件应进行认真挑选以用于优化和应用研究。最后，应该指出的是，这是据我们所知的第一篇关于由戊糖乳杆菌产 EPS 的报道。前言微生物胞外多糖（EPS）是一类范围广泛的分泌多聚物，既可以紧密连接在细胞表面（荚膜多糖），也可以胞外多粘物质分泌到胞外[20]。在自然环境中，多糖与毒力和细胞抗干燥、渗透压、抗生素、毒性物质以及抗菌素或原生动物的攻击有关[11,40]。众所周知，这些分子以作为乳化剂、稠度剂、粘度计和稳定剂应用于食品方面[40]。在由细菌产的 EPS 中，那些由乳酸细菌（LAB）生产的引起了人们越来越多的兴趣，因为这些产品是“食品级”的。由 LAB 生产的 EPS 的流变性质已主要应用于发酵乳制品生产制造业，例如酸奶酪、干酪以及发酵牛奶等方面，而且在肉类发酵和果蔬发酵的精细加工方面也由重要作用[2,33,42,45]。另外，它们也已被证明对人体健康非常有益，例如降低胆固醇、抗癌、免疫活性以及发育等方面的影响[8,29,37]。一些研究表明 LAB 产 EPS 对于在乳制品工业中非常严重的噬菌体感染由部分抗性[16,24]。 LAB 生产的 EPS 可以由一种糖单体构成（同聚多糖），也可以由几种单体构成（杂多糖）。而且，由不

同菌株生产的S在糖成分、链长、支化程度以及糖键类型上有所不月。所有这些因素决定了S的流变学性质和促进健康的性质一可。PS断可以通过生物反应器生产并随着适当的下游处理工艺而进一步作为食品添如剂使用，也可以通过发解工艺原位生产。因此，它们有很大的谱力成为普遍使用的稳定剂和到度剂的替代品。迄今为止，这些P作为生物组分在食晶工业上的使用根大程度上依赖于整个工艺的经济收益，而这些工艺相比于其它传统的由非食品级微生物生产的多聚物如黄原胶或敢覆糖(10到25gL)而言在很多方面受到了LB低产量(0到600gL)的限制。同样应该指出的是，同聚多糖的生产花围要大于杂多糖。在这方面，高效地由LB生产PS的条件应该被优化。众所周知，的生物合成依镜于商株并受到发酵条件和培养基组成的影响。事实上，嗜温菌株似乎在对于细商生长不最适宜的条件下可以达到生产E5的最高水平，然而对于塔热国株来说P5的生产看来是生长相关的。乳酸杆茵经常在乳制品制透中作为混合发解剂使用。此外。大多数成熟干格的次级微生物区主要是由嗜温乳酸杆菌购成，它们对味道和质地有很大的影响。乳酸杆商也是肉类和果装“自然爱酵”的优势微生物区。并作为这些产品的控制发醇的发酵剂面使用问。在乳酸杆菌菌群中，受糖乳杆菌是一种兼性异质发牌微生物，已从多种干酪的外米非发酵剂LB中分离得到：到，并与肉类、鱼类一和果蔬国发醇有关。近年来由乳酸杆商生产PS己按报道.。但老今为止还没有关于由戊糖乳杆商生产S的特点的报道。对此，我门研究了由戊糖乳杆菌山28生产的两种不同的S,这林菌是从嫩梗的自然发酵物中分离得到的。培养条件，碳源和生长速率对5的生产和组成的影利都已被报道，根据我们的结果，两种P 的比率可以被调节并且产物水平可通过培养条作而被促化。材料和方法茵株和培养基条件，戊糖乳杆面LPS26是J,Luiz-Barba and g.J1e'ne2-D'a2在Institut0de 1aGs结C5IC从西班牙绿橄棱发胖物中分离得到的。这个衡株以前因其发醇中城元素反应的过程被技分类成植物乳杆苗四，近期根据分子手段将其分为戊糖乳酸杆亩一。乳酸乳球菌乳酸重种P947是从一块干中分离得到的可，该商株于30°C于S和17肉汤培养基中分别分离纯化，并制成甘油体积分数为20% 的甘油管保存于一80°C。为了得到胞外多糖(Fs),一种优化了的半合成培养基(5则)被采用。它包括吐温80(Teen0 1g/L),柠檬酸按(2/L》、乙酸的(5/L),gS0·7H0(0.1/L)、nS0(0.05/L),aHF0 (2/L)、酵母浸粉(5/L)、蛋白膝(10g/L》、出60这种培养基分测添加不同浓度不同种类的碳源. 对细胞表面进行化学处理：一种按前人记载的方法再进行了细微改动的基础上被利用。每10▣样品过夜培养后以5al以下任何一种溶液重是处理：30%质量分数的十二烷基碳酸钠于45”C下处理30=i: 0,03wa0H于20°C处理30mfm1蛋白所K(1.5/l)于50°C处理30mfn

2 同菌株生产的 EPS 在糖成分、链长、支化程度以及糖键类型上有所不同。所有这些因素决定了 EPS 的流变学性质和促进健康的性质[36,37]。EPS 既可以通过生物反应器生产并随着适当的下游处理工艺而进一步作为食品添加剂使用，也可以通过发酵工艺原位生产。因此，它们有很大的潜力成为普遍使用的稳定剂和稠度剂的替代品。迄今为止，这些 EPS 作为生物组分在食品工业上的使用很大程度上依赖于整个工艺的经济收益，而这些工艺相比于其它传统的由非食品级微生物生产的多聚物如黄原胶或胶凝糖（10 到 25g L-1 ）而言在很多方面受到了 LAB 低产量（40 到 600mg L-1）的限制[11]。同样应该指出的是，同聚多糖的生产范围要大于杂多糖。在这方面，高效地由 LAB 生产 EPS 的条件应该被优化。众所周知，EPS 的生物合成依赖于菌株并受到发酵条件和培养基组成的影响[23]。事实上，嗜温菌株似乎在对于细菌生长不最适宜的条件下可以达到生产 EPS 的最高水平，然而对于嗜热菌株来说 EPS 的生产看来是生长相关的[10]。乳酸杆菌经常在乳制品制造中作为混合发酵剂使用。此外，大多数成熟干酪的次级微生物区主要是由嗜温乳酸杆菌构成，它们对味道和质地有很大的影响[47]。乳酸杆菌也是肉类和果蔬“自然发酵”的优势微生物区，并作为这些产品的控制发酵的发酵剂而使用[4]。在乳酸杆菌菌群中，戊糖乳杆菌是一种兼性异质发酵微生物，已从多种干酪的外来非发酵剂 LAB 中分离得到[27,39]，并与肉类[13]、鱼类[30]和果蔬[38]发酵有关。近年来由乳酸杆菌生产 EPS 已被报道[1,31,41,43]。但迄今为止还没有关于由戊糖乳杆菌生产 EPS 的特点的报道。对此，我们研究了由戊糖乳杆菌 LPS26 生产的两种不同的 EPS，这株菌是从橄榄的自然发酵物中分离得到的。培养条件、碳源和生长速率对 EPS 的生产和组成的影响都已被报道。根据我们的结果，两种 EPS 的比率可以被调节并且产物水平可通过培养条件而被优化。材料和方法菌株和培养基条件：戊糖乳杆菌 LPS26 是 J. L. Ruiz-Barba and R. Jime´nez-Dı´az 在 Instituto de la Grasa-CSIC 从西班牙绿橄榄发酵物中分离得到的。这个菌株以前因其发酵中碳元素反应的过程被分类成植物乳杆菌[25]，近期根据分子手段将其分为戊糖乳酸杆菌[44]。乳酸乳球菌乳酸亚种 IPLA947 是从一块干酪中分离得到的[9]。该菌株于 30°C 于 MRS 和 M17 肉汤培养基中分别分离纯化，并制成甘油体积分数为 20％的甘油管保存于－80°C。为了得到胞外多糖（EPS），一种优化了的半合成培养基（SDM）被采用[19]。它包括吐温 80（Tween 80 1g/L）、柠檬酸铵（2 g/L）、乙酸钠（5 g/L）、MgSO4·7H2O（0.1 g/L）、Mn SO4（0.05 g/L）、K2HPO4 （2 g/L）、酵母浸粉（5 g/L）、蛋白胨（10g/L）、pH 6.0 这种培养基分别添加不同浓度不同种类的碳源。对细胞表面进行化学处理：一种被前人记载的方法再进行了细微改动的基础上被利用[16]。每10ml样品过夜培养后以5ml以下任何一种溶液重悬处理：30％质量分数的十二烷基磺酸钠于45°C下处理30min； 0.05M NaOH于20°C处理30min；蛋白酶K（1.5mg/ml）于50°C处理30min

s的分离纯化：将一种已有记载的方法进行了改进。来自10ml样品的回s是从被ibnC11CV7 超声波仪以30M1出超声波处理了10：i的细胞培养物中提取出来的。然后，样品用10%质量分数的三氯乙酸授拌处理30分钟再在4℃10000g离心10m■以去除细围核蛋白。EP5以2倍体积的酒精沉淀过夜，重溶于1ml 燕篇水中，于4℃中透析(Vw cutoff of12.000tol6,000)48劲，期间每12h换水一次。纯净的EP5被冷冻或遂干以便于进行进一步定量和成分分析， EPS的定量：为了定量分析每一个由L.mt0ss2菌株产生的多聚物，包含S的样品核注射进高压液相色进(C)系统进行过滤层析(SEC).组分用一个以TSK-Ce】recolunn桂保护的T5K-GelG50O0PL 柱收集。流动相是0.1M的NaN0,柱温是40℃，流速是0.6a1/mim,进样量是50a1,多聚物依整以一台410 微分折射计测量的折射率监测出来。一台W96检测器用于监测蛋白存在的可能。右旋糖肝标准用于监测洗酸峰的分子量。5的浓度决定于以5×10心一4.9×101f作为标准值线以Mi11 ennius2010软件计算出来的折射率。单糖的分析：两种EPS (EPS A and EPS)依靠SC从0O▣l培养基中分离得到。收集的片段以蒸馏水透析4以去除来白流动相的Na0然后将其冻干。多糖的成分是依靠根据aldito】cetate方法进行的气相色谱来决定的。样品以丙酮(1u对应每agPS)溶解，通过与evlett-Packard972选择性质量检测器连接的5 eries IⅡBevlett-Packard5890收和按流注射模式操作的一根石英毛细管(Q.25mby30m: SPTW2330)进行分析，烤前的温度保持在220℃，发醇条件：所有的发解实验都是在一个750■1的工作体积的S培养基中进行的.用在含葡萄糖(20g/L) 的SW培养基中30°C过夜培养的培养物以2%体积分数接种。在装璃烧照中进行不控刺加H的发酵。在一个2 升的生物反应器中进行控制的连续发醇.p的控制是通过一个1PD3000/225探针进行测量后自动补加服，7N的N研来实现的。转速是150阳：连续培养是分批进行的。当培养物达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使连续培养开始从最低稀释度下违行。而这些稀释度是不同的(Q,200.11)。三个停留时间的周期足以得到稳态条件· 分别对许多种碳潭（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇）。不月糖浓度(5,20,30和40g/L》。不同温度 (20,25和30°C)以及不月州水平(6,0,5,0和不进行控制)进行了实验。来自分批和连续发酵的样品培养物被提取出米，其细菌的生长情况（以C下/1表示），用（未控制培养物)和产物PS被测定，。每个十进制的稀释度样陪培养物核制成四分之一浓度的Rr溶液。适当稀释度的样品在S瑰脂培养基上扩增。同时，利用PC对糖和有机酸进行监测回，动力学参数：在分批培养中，最大生长率（μ=：）通过实验验证出现在对数生长期。μ=一(1（无-五） /(t,一t》】,其中X和X是CT可/1的数，t,和t,是对数生长期起止时间。PS产率EPS)以每克糖产生的 EPS毫克数表示，单位体积产率()以每小时每升培养液中产生的EP毫克数表示。为了计算这些参数，最

3 EPS的分离纯化：将一种已有记载的方法进行了改进[41]。来自10ml样品的EPS是从被Vibra Cell CV17 超声波仪以30W 1Hz超声波处理了10min的细胞培养物中提取出来的。然后，样品用10％质量分数的三氯乙酸搅拌处理30分钟再在4℃10000g离心10min以去除细胞核蛋白。EPS以2倍体积的酒精沉淀过夜，重溶于1ml 蒸馏水中，于4℃中透析(Mw cutoff of 12,000 to16,000)48h，期间每12h换水一次。纯净的EPS被冷冻或冻干以便于进行进一步定量和成分分析。 EPS的定量：为了定量分析每一个由L.pentosus LPS26菌株产生的多聚物，包含EPS的样品被注射进高压液相色谱(HPLC)系统进行过滤层析(SEC)。组分用一个以TSK-Gel precolumn柱保护的TSK-Gel G5000 PWXL 柱收集。流动相是0.1M的NaNO3，柱温是40℃，流速是0.6ml/min，进样量是50ul。多聚物依靠以一台410 微分折射计测量的折射率监测出来。一台UV 996检测器用于监测蛋白存在的可能。右旋糖酐标准用于监测洗脱峰的分子量。EPS的浓度决定于以5×104－4.9×106 Dal作为标准曲线以Millennium 2010软件计算出来的折射率。单糖的分析：两种EPS (EPS A and EPS B) 依靠SEC从400ml培养基中分离得到。收集的片段以蒸馏水透析48h以去除来自流动相的NaNO3然后将其冻干。多糖的成分是依靠根据alditol acetate方法进行的气相色谱来决定的[48]。样品以丙酮（1ul对应每ug EPS）溶解，通过与Hewlett-Packard 5972选择性质量检测器连接的Series II Hewlett-Packard 5890仪和按流注射模式操作的一根石英毛细管（0.25 mm by 30 m; SPTM 2330）进行分析。烤箱的温度保持在220℃。发酵条件：所有的发酵实验都是在一个750ml的工作体积的SDM培养基中进行的。用在含葡萄糖（20g/L）的SDM培养基中30°C过夜培养的培养物以2％体积分数接种。在玻璃烧瓶中进行不控制pH的发酵。在一个2 升的生物反应器中进行控制pH的连续发酵。 pH的控制是通过一个InPro 3000/225探针进行测量后自动补加5.7N的NH4OH来实现的。转速是150rpm。连续培养是分批进行的。当培养物达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使连续培养开始从最低稀释度下进行。而这些稀释度是不同的(0.02 to 0.11 h－1 )。三个停留时间的周期足以得到稳态条件。分别对许多种碳源（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），不同糖浓度（5，20，30和40g/L），不同温度（20，25和30°C）以及不同pH水平（6.0，5.0和不进行控制）进行了实验。来自分批和连续发酵的样品培养物被提取出来，其细菌的生长情况（以CUF/ml表示），pH（未控制pH 培养物）和产物EPS被测定。每个十进制的稀释度样陪培养物被制成四分之一浓度的Ringer溶液。适当稀释度的样品在MRS琼脂培养基上扩增。同时，利用HPLC对糖和有机酸进行监测[5]。动力学参数：在分批培养中，最大生长率（μmax）通过实验验证出现在对数生长期，μmax＝〔ln（X1-X0） /（t1－t0）〕，其中X1和X0是CFU/ml的数，t0和t1是对数生长期起止时间。EPS产率(YEPS)以每克糖产生的 EPS毫克数表示，单位体积产率(Pv)以每小时每升培养液中产生的EPS毫克数表示。为了计算这些参数，最

大细商量（决定于对数生长期末）和最大S产率（决定于发醇时期末）鼓使用。在连续培养中，当条件稳定时动力学参数被确定下米。PV以在每个稀释度下以每升发醇物中的S毫克数表示，以牛奶进行培养：单独的戊糖乳酸杆商PS26纯培养或成糖乳酸杆商PS26和乳酸乳球菌乳酸亚种 ILA94T混合培养是在添加了2%的脱脂乳糖分术的商品H培养基中进行的。先分别在S和W17培养基上分别过夜培养，以它们作为接种体在25°C下培养72小时后每毫升戊糖乳酸杆陶LP526长出了2×10个南落，乳酸乳球菌乳酸亚种I风A917则长出了7.5×1心个。需要指出的是牛奶是连同葡萄糖(0.5%〔t/Dl】) 和醇母浸松(a.5%(t/wo】)一起加入的。S26的计数是在S平板上适当稀释涂平板来完成的，IPHA94行是在17平板上进行的。平板在30°C下培养了8小时并进行了重复。PS是按前文所述的方法进行定量的。为了排除修母浸粉对补如了牛奶后的EP巧定量的影响。接种的样品被监测是否含有对结果有影响的多聚物存在，。牛奶发酵物的黏度是以乳酸乳球菌乳酸亚种IP刊A947纯培养物为基准利用Posthumzs方法监测出米的。统计学分析：数据依靠电脑款件进行了楚异分析和最小差异意义监测分析验证(P001)。结果：经离心，戊糖乳杆菌S26呈现出松载的颗粒状沉淀。在SR琼脂中。菌落呈绳状，这说明菌体产生了多聚物。为了正明它的胞外多糖特性，我们做了初步的检测一一对细胞表面进行化学处理。用蛋白酶K 或者S5处理并不影响颗粒状沉淀的粘性，然而用N州处理却导致产生无粘性沉淀，这说明了胞外多糖的存在。 EPS B EPSA 33x10Da 1.9x10Da 烟四油游信w袖的碳丽 F门G.1.Siot eucrsion d山egm showing he teo于形prodsord by L.emboe LP巧kDul同ises fiask the fadices ooll谢fer sugat E5分离和原组成：30℃条件下，在补充了葡毯，的5W培养基中培养戊林乳杆陶P526《不控川) 达？2小时。开的时，在培养液上清中不能分离到，表明PS可能完全依附在细胞表面上。事实上，用温和的超声波处理培养基能导致PS从细胞表面释放，离心后形成坚硬的无粘性的沉淀。这些观察结零表明由L.p2糖乳杆南26产生的E5是一种英限多糖。随后，E下技提取出来，并上桂于SEC柱中进行H州C分析

4 大细菌量（决定于对数生长期末）和最大EPS产率（决定于发酵时期末）被使用。在连续培养中，当条件稳定时动力学参数被确定下来。Pv以在每个稀释度下以每升发酵物中的EPS毫克数表示。以牛奶进行培养：单独的戊糖乳酸杆菌LPS26纯培养或戊糖乳酸杆菌LPS26和乳酸乳球菌乳酸亚种 IPLA947混合培养是在添加了2％的脱脂乳糖分末的商品UHT培养基中进行的。先分别在MRS和M17培养基上分别过夜培养，以它们作为接种体在25°C下培养72小时后每毫升戊糖乳酸杆菌LPS26长出了2×107个菌落，乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947则长出了7.5×106个。需要指出的是牛奶是连同葡萄糖（0.5％〔wt/vol〕）和酵母浸粉（0.5％〔wt/vol〕）一起加入的。LPS26的计数是在MRS平板上适当稀释涂平板来完成的。IPLA947 是在M17平板上进行的。平板在30°C下培养了48小时并进行了重复。EPS是按前文所述的方法进行定量的。为了排除酵母浸粉对补加了牛奶后的EPS定量的影响，接种的样品被监测是否含有对结果有影响的多聚物存在。牛奶发酵物的粘度是以乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947纯培养物为基准利用Posthumus方法[46]监测出来的。统计学分析：数据依靠电脑软件进行了差异分析和最小差异意义监测分析验证（P<0.01）。结果: 经离心，戊糖乳杆菌 LPS26 呈现出松软的颗粒状沉淀。在 MSR 琼脂中，菌落呈绳状，这说明菌体产生了多聚物。为了证明它的胞外多糖特性，我们做了初步的检测——对细胞表面进行化学处理。用蛋白酶 K 或者 SDS 处理并不影响颗粒状沉淀的粘性，然而用 NaOH 处理却导致产生无粘性沉淀，这说明了胞外多糖的存在[16]。 EPS分离和糖源组成：30℃条件下，在补充了葡萄糖的SDM培养基中培养戊糖乳杆菌LPS26（不控制pH）达72小时。开始时，在培养液上清中不能分离到EPS，表明EPS可能完全依附在细胞表面上。事实上，用温和的超声波处理培养基能导致EPS从细胞表面释放，离心后形成坚硬的无粘性的沉淀。这些观察结果表明由L.p戊糖乳杆菌26产生的EPS是一种荚膜多糖。随后，EPS被提取出来，并上柱于SEC柱中进行HPLC分析

分析显示存在分别应两个峰的两种多聚物。一种大分子量(1-从)多聚物(PSA),分子量为1.9×10心 Da,另一种小分子量多聚物(PS卧，分子量为3.3×10a(Fi品.1). TABLE 1.Composition of the two EPS produced by L.pentosus LPS26" Sg2 ar compositio国（号） EPS Glucose Rhamnose Mannose A 73 27 0 B 76 0 24 Incubation was performed in batch cultures a 30C without pH control in SDM supplemented with ghucose (30 g liter")as the carbon source. 气相色谱一质谱分析显示两种的单糖组成是不同的(Tabl©1)。巧A由葡萄糖和鼠李糖组成，其物质的量之比近叙为3,1，然而PSB由葡萄糖和甘露糖组成，比例相似。分批培养发酵产生EPS:我们测定了多种参量，如城源及浓度。出，和温度，来探素每种包S发醇的最佳条件。 TABLE 2.Effect of carbon source on growth and EPS production by L.pentosus LPS26" Mamum Carbon Amt of EPS (mg liter-)" rOsh° EPS AEPS B s0u元e EPS A EPS B Total (CF可Uml-4) ratio Fructose 26.3 55.6 81.9 1.5×10m 37 Mannitol 91.2b 34.6伊 125.8 2.4×10 73 Glucose 134.0 320P 166.0 1.3×10 82 Lactose 116.6 483 164.年 5.8×10*h 73 Ineuhation was performed in hatch cuhtures at 30C without pH control for 72 h in SDM supplemented with 30 g of each carbon source liter Data are mean values (3).Within the same column,means with the same sperseript letter are not significantly dilferent (P 0.01). "Data are mean wulues (n 3)Within the column,means with the same superscript letter are not significantly ditferent (P>0.01). 我们在5暗养基中添加葡萄糖，果糖和甘露醇（存在于嫩棱计中）和乳糖来研究碳源对菌体生长和 EPS产量地影响。碳源的浓度为30克每升，发酵温度为30℃。Tb1e2概括了所得的结果。甘露醇和果糖分别提供了最高(2.4×10可)和最，《1.5×1GCF啊)的活茵数，但是甘露醇和葡萄糖之阿没有检测到明显的差别(P0,01)。果糖和甘露醇导致较低的5合成(P<001),然而葡萄糖和究糖则是更适合FS产生的糖源。大分子量PS(SA》似乎比小分子量EPS(B)更依载于特定碱源，因为它的形成有更多的差异性(T动1.2)，用甘落醇，葡萄糖和乳糖发酵得刊的SA占有更高的比率。但是，用果糖发酵则得到相反的比率。用不列碳源发醇。两种S的单糖组成的差异都很小。在疹A中，葡面糖组成范围是71到80%。鼠李糖组成范围是2作到29%：而在PSB中，箱萄糖组成范围是0%到76裤，甘露糖组成 5

是2%到30%（未显示数据）。在接下米的实验中，选择葡萄糖作为碳源. TABLE 3.Effect of ghucose concentrution on growth and EPS production by L.pentosus LPS264 Gluceoe Amt of包Ps(mg liter-'r Ma道mum conen growthe (mg of EPS g (g liter-) EPS A EPS B Total (CFU ml) of ghscese) 84.9r 4994 134.0P 3.6×10 41.34 20 101.8 473 149.2 8.5×10 10.1 30 134.6 321- 166.7 13×10地 12.4 40 1255" 484 173.8 7.2×10* 8.2 Incubation was performed in batch cultures at 3C without pH control for 72 h in SDM supplemented with glucose as the carbon source. Data are mean values (n 3).Within the same column,means with the same perscrip倒let钱er are not significantly di任erent(P>0Ol). "Data are mean values (n 3).Within the column,means with the same superscript letter are not significantly different (P 001). 为了测定葡萄糖浓度的任问影响。我们在30℃条件下，分批发酵72小时，并测定不同葡面糖浓度下多聚物的产量(Tab13).随着糖辉浓度增加，活菌数增多，对数生长期变长。在20到30克每升葡国糖浓度范围内。没有粒测到最著的差异(>0,01)。关于总的P产量，在发醇8小时日首次检测到，并且随着初始葡萄糖浓度的增加，其合成有显著的增加(P(0.01)。葡司糖浓度在5克每升时，EPS产量最大(4L.3gP 每g葡阁糖消耗)，然面当葡萄糖浓度在20到0克每升时，S产量保持在很窄的范国内(8.2到12.4gS 每g葡萄糖)(P(0.01).无论箱萄糖浓度如何，PSA和PSB的比率实际上并不改变，另一方面，还分析了分批培养的代谢终产物。随着培养基葡萄糖浓度的增加乳酸盐的产量也逐渐增加。这种代谢消耗裤到8 的糖类，尽管在分批培养流出物中积累了乙酸盐(41t057W)和更少量的甲酸盐(0.4t008W). 在所有的检测中都使粒测出制余的碳尊（起始浓度的2%和55路》（数据没有给出）. 在三个不同的温有温度(20,25,35℃)进行分批培养，以葡萄糖(30g/L)作为孩源、温育72h、不调节培养基的酸碱度（图2）。温度影响两种PS的产量，从PSA的产量可以看出温度与PS的产量呈负相 6

160 100 120 10 100 10 E 6 LPS20+PLA347 LPS20+IPLA947 isp) LPS26 (8pl ☐EPSA LPSB WZ☑Ut'LPsa西▣GUr十IPUe47 G及Gwn同EP西MdEP秀钙L.pes LPST6 in pure and miced d由的G生hs.Caltes were inouhald at2S℃gT2a 19了nciale m盘ed满hkee%1e00d网raa05号t非Tned白moan valiys■3升it每h解 ne vartahles-书productin.cel guwth.an时Syiddd meats wih the sme lwverane ktter ane mot sg口ncastl dtkren (P>gath 牛奶中的S产量：为了估计这种产E5的L,pet0 sus LPS26南株利用奶制品发酵的能力，并检测在牛奶中的产量和EPS产率，我们在牛奶中进行发醇。单貌的Lent0s阳sLS2B无法在牛奶中生长，很可能是因为它对牛奶酪蛋白的低分解能力《未显示数据)·因此。需要向牛奶中补加葡萄糖和酵厚提取物。在补充了的牛奶中述行单培养，1P526可以达到100FU1并产生140.1g总每升.在牛奶和补如葡匈糖和解母提取物的牛奶中，对LPS25和酸化的L.1 actisi进行联合培养。在牛奶培养基中，EP5产量很低(12.8ag每升)，并且主要产生的是PSB.LP26达到63×10CF而■1。而1风947的活菌量达到62×10C可1，对牛奶培养基述行补充后，则不仅微生物量有了明暴的增如(LP5252.5×10CFUn1和IPLA9471.8×10CF可 )而且主要由于EP5B有了极大的增长，5总产量也有了明显的增长(16说.g每升)《图.5》·总的说来，加入牛奶中的补充物极大地影响了的产量和话商量(P(0.01)。然面，速憾的是，在产菌株P存在的情况下。用米发酵的牛奶的粘度并没有什么变化。讨论据我门所知。这是第一篇关于戊糖乳杆菌的一个商株产生的表多糖的文章。戊糖乳杆菌山P26这株菌常用于绿嫩棱发醇，它会产生一个包含两种型外多糖的英膜聚合物，这两种胞外多糖在分子大小和含糖成分上有所不月。关于戊糖乳杆蘭产生不止一种5合成物目前己经被报道成。比：产生两种分子量分别是8.5×1Cand4×10D归且含糖成分不同的多聚物已经在植物乳杆官P6这株菌中观察到了四. A上的葡萄糖和佩李糖通常是多数S所特有的量地，其中关于它打核背酸前体及多糖链的合成的机制己经明确可。但却没有那算文献上有可以解释L48产生的PS(桑多糖)中的甘露糖单位的合成代谢途径的数据，尽管这种糖的存在已经被证实回。一些学者认为检测到甘露糖、同拉伯糖或者木糖是因为培养基成分中细胞壁组分的污染。比如来自酵母提取物和蛋白蒋中的葡糖甘露案糖，这些会影响到即S的分离、纯化和结构鉴定。然面，使用像随这样的培养基也具能减少这些干扰成分的出现。面且，分析 9

9 牛奶中的EPS产量：为了估计这种产EPS的L.pentosus LPS26菌株利用奶制品发酵的能力，并检测在牛奶中的产量和EPS 产率，我们在牛奶中进行发酵。单独的L.pentosus LPS26无法在牛奶中生长，很可能是因为它对牛奶酪蛋白的低分解能力（未显示数据）。因此，需要向牛奶中补加葡萄糖和酵母提取物。在补充了的牛奶中进行单培养，LPS26可以达到109 CFU ml-1并产生140.1mg总EPS每升。在牛奶和补加葡萄糖和酵母提取物的牛奶中，对LPS26和酸化的L.lactis进行联合培养。在牛奶培养基中，EPS产量很低（12.8mg每升），并且主要产生的是EPS B。LPS26达到6.3×107 CFU ml-1，而IPLA947的活菌量达到6.2×108 CFU ml-1。对牛奶培养基进行补充后，则不仅微生物量有了明显的增加（LPS26 2.5×108 CFU ml-1和IPLA947 1.8×109 CFU ml-1）而且主要由于EPS B有了极大的增长，EPS总产量也有了明显的增长（162.9mg每升）（图.5）。总的说来，加入牛奶中的补充物极大地影响了EPS的产量和活菌量（P <0.01）。然而，遗憾的是，在产EPS菌株LPS26存在的情况下，用来发酵的牛奶的粘度并没有什么变化。讨论据我们所知，这是第一篇关于戊糖乳杆菌的一个菌株产生的表多糖的文章。戊糖乳杆菌 LPS26 这株菌常用于绿橄榄发酵，它会产生一个包含两种胞外多糖的荚膜聚合物，这两种胞外多糖在分子大小和含糖成分上有所不同。关于戊糖乳杆菌产生不止一种 EPS 合成物目前已经被报道[11,18,26]。比如：产生两种分子量分别是 8.5×105 and 4×104 Da 且含糖成分不同的多聚物已经在植物乳杆菌 EP56 这株菌中观察到了[41]。 EPSA 上的葡萄糖和鼠李糖通常是多数 EPS 所特有的[22,34]，其中关于它们核苷酸前体及多糖链的合成的机制已经明确[12]。但却没有那篇文献上有可以解释 LAB 产生的 HePS（杂多糖）中的甘露糖单位的合成代谢途径的数据，尽管这种糖的存在已经被证实[21]。一些学者认为检测到甘露糖、阿拉伯糖或者木糖是因为培养基成分中细胞壁组分的污染，比如来自酵母提取物和蛋白胨中的葡糖甘露聚糖，这些会影响到 EPS 的分离、纯化和结构鉴定[6]。然而，使用像 SDM 这样的培养基也只能减少这些干扰成分的出现[19]。而且，分析

未经变质处理的培养基用同样的方法进行培养并没有显示出任何多聚物的出现，从而证实甘露糖是S邻的一种组成成分。我们的结果显示培养条件对无糖乳杆商的生长和产生P5有明显的影响。我们能够证明用分批培养是 PS产量高达511m眼/L,与那些描述LB产生桑多糖中ES产量在150-00g/L相比己经是根高的水平。尽管如此，距离在4超中产E5最高的眼李糖乳杆菌需-959M菌侯(1275/L)仍有很大的差距细。值阁注意的是，不同测试条件会影响商株产生这两种PS的产量，因此，两种PS的产生比率可被调节。碳源对戊糖乳杆商PS28的生长和产生PS的量以及两种PS的比率有明显的影响。葡萄糖提供EPS 的高产量而且明显更支持巧A的合成。相反，果糖更利于EPSB的合成。在Lde1 brueckii subsp, b如lgaricus NCF用2772中也能观察到同样的现象，即利用葡萄糖它能产生巨SA和PSB,比率为1：1 而利用果糖几乎只能产生S圆。在我们的实验中，戊糖乳杆菌S28的生长和S的产生无直接联系，因为最大活茵数量与ES的最大产量并不相符。这种现象在乳酸杆宿和乳酸球菌回菌株中也有描述。我们仅仅观察到了使用不同浓度的葡阁糖对5的产生有少量的影响。有逐的是，最低糖浓度时葡萄糖的单位产S量是最高的，糖原的过量并不能刺董PS的合成。只会降低合成的效率，较低温度时究A和ESB的产量会增加，这是适常温产EPS乳酸杆菌的共有特征。这种亚最佳的生长条件导致了S产量的增加圆。对于这种现象的解释。通常认为缓慢生长的细胞显现出缓慢的细敷摩复合物的生物合成回，会有更多的影质运载体的前体分子在5的合成中被利用。阳值的控制同样可增强成糖乳杆商PS28产生5的能力。H值的控制对ESA的产生有利，目它主要有助于B的合成。月封，我们再次观察到了茵体生长和S的生产之间并不倒联。因为用6.0时茵体数量达最大而服0时PS 的产量达到最大，这与以前的报道相反测通过连续培养得到的结果表明P巧A和PSB有着不同的生产动力学。ESA主要在一个非常低的稀释率(Q.02h),因此PSA的生产鼓认为是非生长相联系。这个发现与分批培养得到的站果一致，分批培养时EP5A的生产主要在指数生长期的末拥并且培养至少72小时后才能被检测到。不月的是，5B的生产并不受生长速半的影响。尽管ES的生产有根大区别，但相似的糖消耗与乳酸盐生产在一个低的 D(0.02-0,0h)敲也观察到。这个发现表明在最低稀释度的葡萄糖清耗对PS合成途径的更换更有效，因此，糖类作为一种重要的碳源组成部分被吸牧后代谢成为与5合成有关的核糖核苷酸前体物质。对于像LB生产P5这样的生物原料的生产过程来说连续培养比分批培养更有效果因为连续培养可消除内在的诸如清洗。灭菌及有机体进入高生产前漫长的滑后期这样的无用时间。另外，连续培养是一个高度自动化的过程，减少了劳动酒耗。在这种情况下。超大体积(7.08Lh)的稀释度为Q02h的生产与同悍条件的分批培养就很相似了。然而，分批培养中清洗、灭阑的时间需要在连续培养中将不会被计算透来，因此连续培养的体积生产量将更高。 10

10 未经变质处理的培养基用同样的方法进行培养并没有显示出任何多聚物的出现，从而证实甘露糖是 EPSB 的一种组成成分。我们的结果显示培养条件对无糖乳杆菌的生长和产生 EPS 有明显的影响。我们能够证明用分批培养是 EPS 产量高达 511mg/L，与那些描述 LAB 产生杂多糖中 EPS 产量在 150-600mg/L 相比已经是很高的水平[7]。尽管如此，距离在 LAB 中产 EPS 最高的鼠李糖乳杆菌 RW-9595M 菌株（1275 mg/L）仍有很大的差距[14]。值得注意的是，不同测试条件会影响菌株产生这两种 EPS 的产量，因此，两种 EPS 的产生比率可被调节。碳源对戊糖乳杆菌 LPS26 的生长和产生 EPS 的量以及两种 EPS 的比率有明显的影响。葡萄糖提供 EPS 的高产量而且明显更支持 EPS A 的合成。相反，果糖更利于 EPS B 的合成。在 L. delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772 中也能观察到同样的现象，即利用葡萄糖它能产生 EPS A 和 EPS B，比率为 1：1 而利用果糖几乎只能产生 EPS B[18]。在我们的实验中，戊糖乳杆菌 LPS26 的生长和 EPS 的产生无直接联系，因为最大活菌数量与 EPS 的最大产量并不相符。这种现象在乳酸杆菌[15]和乳酸球菌[23]菌株中也有描述。我们仅仅观察到了使用不同浓度的葡萄糖对 EPS 的产生有少量的影响。有趣的是，最低糖浓度时葡萄糖的单位产 EPS 量是最高的，糖原的过量并不能刺激 EPS 的合成，只会降低合成的效率。较低温度时 EPS A 和 EPS B 的产量会增加，这是适常温产 EPS 乳酸杆菌的共有特征，这种亚最佳的生长条件导致了 EPS 产量的增加[10]。对于这种现象的解释，通常认为缓慢生长的细胞显现出缓慢的细胞壁复合物的生物合成[40]，会有更多的脂质运载体的前体分子在 EPS 的合成中被利用。pH 值的控制同样可增强戊糖乳杆菌 LPS26 产生 EPS 的能力。pH 值的控制对 EPS A 的产生有利，但它主要有助于 EPS B 的合成。同时，我们再次观察到了菌体生长和 EPS 的生产之间并不偶联，因为 pH 5.0 时菌体数量达最大而 Ph6.0 时 EPS 的产量达到最大，这与以前的报道相反[17,28]。通过连续培养得到的结果表明 EPS A 和 EPS B 有着不同的生产动力学。EPS A 主要在一个非常低的稀释率（0.02h-1），因此 EPS A 的生产被认为是非生长相联系。这个发现与分批培养得到的结果一致，分批培养时 EPS A 的生产主要在指数生长期的末期并且培养至少 72 小时后才能被检测到。不同的是，EPS B 的生产并不受生长速率的影响。尽管 EPS 的生产有很大区别，但相似的糖消耗与乳酸盐生产在一个低的 D(0.02-0.04h-1 )被也观察到。这个发现表明在最低稀释度的葡萄糖消耗对 EPS 合成途径的更换更有效。因此，糖类作为一种重要的碳源组成部分被吸收后代谢成为与 EPS 合成有关的核糖核苷酸前体物质[3]。对于像 LAB 生产 EPS 这样的生物原料的生产过程来说连续培养比分批培养更有效果因为连续培养可消除内在的诸如清洗、灭菌及有机体进入高生产前漫长的滞后期这样的无用时间。另外，连续培养是一个高度自动化的过程，减少了劳动消耗。在这种情况下，超大体积（7.08mgL-1 h -1）的稀释度为 0.02h-1 的生产与同样条件的分批培养就很相似了。然而，分批培养中清洗、灭菌的时间需要在连续培养中将不会被计算进来，因此连续培养的体积生产量将更高

南开大学 案例 培养条件决定由戊糖乳杆菌LPS26生产的两种外多糖的平衡_微生物发酵工程

南开大学案例培养条件决定由戊糖乳杆菌LPS26生产的两种外多糖的平衡_微生物发酵工程