通过扩增青幕素生物合成基因熊提高产黄青幕在州态和液老发醇中的青得素产量 (张燕) 辅要：产黄青而各个茵株中青霉素产量的高低受到一种含有全部青需素生物合成基因截的粘性 质粒的影响。该质粒文岸构建于一个新开发出的粘性质粒载体一一IztapaC0s中，1 ztapaCos质粒载 体适合将较大的NA片段复制并直接转化进入真菌细胞，并以对腐草霉素（由]ocin)的抗性作 为这择标记。实验中分别在液态发醇SF)和因态发酵(SSF)中对基因扩增应用于青霉素产量的影响 进行了评告。由青霜素低产株1s51255的转化南株在固方和液态发酵中的青霉素产量分别提高 了67.3%和28.3%，由高产株P2-32的转化商株产量则分别提高了92.9%和158.%。其中2-32菌 株原本已含有大约14个青霉素生物合成基因截的将贝，这说明了扩增基因含量的策略在高拷贝数的 两株中同样有效。文中将对以上两种两株在两种发解条件下的不阴表现以及此法在青霜素工业化生 产中的推广进行讨论。 关健司：青霉素基因簇扩增青荷素产量提高液态及国态发醒 翰言 人们曾对产生青荷素的真面一一产黄青荷(Penie1111 um chrys0um)采取过多种不月的菌株 优化方案，包括随机突变和基因工程。当三个青霉素合成的结构基因(pch,B,pcC和pemE)被鉴定 D'ez et al.19g0:Saith et al.1990)出来后，这些基因的过表达麓成为了被应用的方法之一， 对构巢曲荷(Asperg1 llus n1d加lans)的研究指出基因acvA(pcbAB)是控制青荷素产量的关 健基因，而基因ipnA(pcbC)和a麟t(eDE)则不然。当基因aCvA过表达时，青霜素的产量增加 了30倍(Kenned山&Turner1996》。然而，用相月的可诱导启动子诱导过表达基因iml和at时， 尽管相关衡的活性得到了很大提高，如异青荷素X合成酶活性提高0倍而异青等素N乙酰基转移酶 提高8倍(Ferna'ndez-Cano'n&Pen°alva1995),国对青霜素产量只有微霜的影响（产量提高了 25). 增加生物合成基因持贝数的方法在产黄青霉与对构果由莓中得到的结果在某些方面不尽相同， 当基因cC和pDE均转入产黄青霉is54-1255中后。一些转化西株的青霉素产量比原始菌株高 出40%(Veenstra et al.1S的1).然而，贝有当整个青霉素基因熊(pcbB-pctC-penDE)全部被 月于转化进产黄青霉时才能获得最好的结果一一青霉素产量提高130一2T0%(Tei1 gaard et al.. 01),该研究还表明。与构果由霉的实验结果相反，仅因心bAB单验过表达并不会明显提高青霉 素的产量， 上述研究均是利用产黄青霉154-1255完成的，is54-1255仅含有一个青需素基因餐的拷贝 并且能产生少量的抗茵素，而且实验结果只适用于液态发醇。本实验中，我们树比了在转入整个青
通过扩增青霉素生物合成基因簇提高产黄青霉在固态和液态发酵中的青霉素产量 （张蕊） 摘要： 产黄青霉各个菌株中青霉素产量的高低受到一种含有全部青霉素生物合成基因簇的粘性 质粒的影响。该质粒文库构建于一个新开发出的粘性质粒载体——IztapaCos 中，IztapaCos 质粒载 体适合将较大的 DNA 片段复制并直接转化进入真菌细胞，并以对腐草霉素（phleomycin）的抗性作 为选择标记。实验中分别在液态发酵(SmF)和固态发酵(SSF)中对基因扩增应用于青霉素产量的影响 进行了评估。由青霉素低产株 Wis 54-1255 的转化菌株在固态和液态发酵中的青霉素产量分别提高 了 67.3%和 28.3%，由高产株 P2-32 的转化菌株产量则分别提高了 92.9 %和 158.4%。其中 P2-32 菌 株原本已含有大约 14 个青霉素生物合成基因簇的拷贝，这说明了扩增基因含量的策略在高拷贝数的 菌株中同样有效。文中将对以上两种菌株在两种发酵条件下的不同表现以及此法在青霉素工业化生 产中的推广进行讨论。 关键词：青霉素基因簇扩增 青霉素产量提高 液态及固态发酵 前言 人们曾对产生青霉素的真菌——产黄青霉（Penicillium chrysogenum）采取过多种不同的菌株 优化方案，包括随机突变和基因工程。当三个青霉素合成的结构基因(pcbAB, pcbC 和 penDE)被鉴定 (Dı´ez et al. 1990; Smith et al. 1990)出来后，这些基因的过表达就成为了被应用的方法之一。 对构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的研究指出基因 acvA（pcbAB）是控制青霉素产量的关 键基因，而基因 ipnA（pcbC）和 aat（penDE）则不然。当基因 acvA 过表达时，青霉素的产量增加 了 30 倍（Kennedy & Turner 1996）。然而，用相同的可诱导启动子诱导过表达基因 ipnA 和 aat 时， 尽管相关酶的活性得到了很大提高，如异青霉素 N 合成酶活性提高 40 倍而异青霉素 N 乙酰基转移酶 提高 8 倍（Ferna´ndez-Can˜o´n & Pen˜alva 1995），但对青霉素产量只有微弱的影响（产量提高了 25%）。 增加生物合成基因拷贝数的方法在产黄青霉与对构巢曲霉中得到的结果在某些方面不尽相同。 当基因 pcbC 和 penDE 均转入产黄青霉 Wis54-1255 中后，一些转化菌株的青霉素产量比原始菌株高 出 40%（Veenstra et al. 1991）。然而，只有当整个青霉素基因簇（pcbAB–pcbC–penDE）全部被 用于转化进产黄青霉时才能获得最好的结果——青霉素产量提高 130—270%（Theilgaard et al. 2001），该研究还表明，与构巢曲霉的实验结果相反，仅基因 pcbAB 单独过表达并不会明显提高青霉 素的产量。 上述研究均是利用产黄青霉 Wis54-1255 完成的，Wis54-1255 仅含有一个青霉素基因簇的拷贝 并且能产生少量的抗菌素，而且实验结果只适用于液态发酵。本实验中，我们对比了在转入整个青
而素基因候后低产南株(s54-1255)和高产两株(2-32)青霉素产量的差别，并且首次应用此法 检测转化菌株在新兴的固态发酵(SSF)技术(Suryanarayar通2003：Barrios-Go2a1e2 and MeJt'a 2007)中的反应. 材料和方法 菌株 产黄青霜is54-1255(AT0C2808的)一青需素低产商株，而产黄青霉is54-1255pe10是产 青霉素脆力诚钢的一种派生菌株，其青霉素基因截不完整(Cantora】etal.1993;Fierro et al,. 1995)力产黄青霉2-32一一青需素高产苗株。再分离2在国态发醇中表现良好，在保持其在流老 发酵中的产量水平(Barrios--Conza'1e经etaL.1993)的同时可容纳青看素基因候以串联重复的 方式扩增数倍，产黄青而NL1951(野生型)一一用作基因文库的DNA源：枯草芽孢杆菌AT0C33 一一用于在生物测定中评估青霉素G的产量：大肠杆菌5一一用于粘性质较基因文库和一般基因 操作的受体。 质教载体IztapaCos 本实验中构建大小为8.7bp(图1)的粘性质粒Izt即aCos,包含以下元素：cos区、多克隆位 点（由Supercos提取并转入由质粒C3突变得到的顺粒Ixtapa中）、作为真菌选择标记的腐草 霉素抗性基因位点（基因be),到除PstI和X沿aI的限制性南切位点。 Sal Xbal Pvull 物国 F1( Ec成I Sspl eri Nodl rt写aCas BemHI Pyull Cm(R) fcm则 800hP Sapl 一leo则 ColE] C A ble Pvull Sdl Neol EcoRV Hndm Kpel Xhol Smd 图1 IztapeC0s,大小为8.6kb的粘性质粒，包含腐草军素抗性基因位点、 氯幕素抗性标记、E.co11的复制原点、c0s区和一个多克隆位点 (邢跃) 基因组文率的构魂 从野生型首株产黄青霉风.1951提取的全部基因用Su3】部分消化，去南酸化，连入被
霉素基因簇后低产菌株（Wis54-1255）和高产菌株（P2-32）青霉素产量的差别，并且首次应用此法 检测转化菌株在新兴的固态发酵（SSF）技术（Suryanarayan 2003; Barrios-Gonza´lezand Mejı´a 2007）中的反应。 材料和方法 菌株 产黄青霉 Wis54-1255（ATCC28089）——青霉素低产菌株，而产黄青霉 Wis54-1255 npe10 是产 青霉素能力减弱的一种派生菌株，其青霉素基因簇不完整（Cantoral et al. 1993; Fierro et al. 1995）；产黄青霉 P2-32——青霉素高产菌株，再分离 P2 在固态发酵中表现良好，在保持其在液态 发酵中的产量水平（Barrios-Gonza´lez et al. 1993a）的同时可容纳青霉素基因簇以串联重复的 方式扩增数倍；产黄青霉 NRRL 1951（野生型）——用作基因文库的 DNA 源；枯草芽孢杆菌 ATCC 6633 ——用于在生物测定中评估青霉素 G 的产量；大肠杆菌 DH5a——用于粘性质粒基因文库和一般基因 操作的受体。 质粒载体 IztapaCos 本实验中构建大小为 8.7kbp（图 1）的粘性质粒 IztapaCos，包含以下元素：cos 区、多克隆位 点（由 Supercos 提取并转入由质粒 pULC43 突变得到的质粒 Iztapa 中）、作为真菌选择标记的腐草 霉素抗性基因位点（基因 ble）、删除 PstI 和 XbaI 的限制性酶切位点。 图 1 IztapaCos，大小为 8.6kb 的粘性质粒，包含腐草霉素抗性基因位点、 氯霉素抗性标记、E.coli 的复制原点、cos 区和一个多克隆位点 （邢跃） 基因组文库的构建 从野生型菌株产黄青霉 NRRL 1951 提取的全部基因用 Sau3A1 部分消化，去磷酸化，连入被
BamH-XaI酒化的IztapaCos我体。连接反应用Gigapack kit(Stratagene),扩增和后期对基因 文库的操作均采用标准化技术， 基因组文库的缔速 将基因组文库置于一个可以计数30000f和/dish的培养Ⅲ内，作为一个刚本。在两个培养中 分别放置一张蕾正电的尼龙膜(lybond-N)(nershan),用经典方法为桑交做准备，在这两张尼龙 膜上分别用不月的探针进行杂交：一个用cAB深针，以TC6 ACTATGTGGGTCTAGACCT和 OGCTGTAAAGGTAACGCICTTAAGG为引物通过CR方法获得，并包括基因pcbAB编码区的3”末端序列和 3”TR的起始序列：另一个使用penE探针，它是一个大小为Q3kb的片段，由lindIII南切质 粒L几33(D2etal,1989)而获得，包含基因pe呢的3'末端序列。两种探针都通过切口转 移标记上a-P-TP。桑交用的尼龙模于暗盒中在-0T条件下用1ef11螺胶片W光1小时， 真潮的转化 对产黄青荷1s54-1255ne10、is54-12写和P2-32均按上述方式(Cantoral et al,1987: D'ez et al,.1987)进行转化，用浓度为30=g/l的离草霜素在Czapek-Sorbitol(1M)培养琴上 筛途转化菌株，用于转化的基因为经碱爱解法由E,©ol1中提取的4p的克隆粘性质粒（见“结果” 部分)。将得到的转化菌株转移到腐草霉素浓度为刘-8即单/：l的梯度培养基中培养，从而锋选出 高择贝的转化两株。 青幕素在琼脂上的产量 将各转化南株的南纶体分别接种到改良的50 erson培养基(z/1,乳糖110葡萄糖14，CaC0,20, 阻F06,Mg5S0,708,容物浸提液70，苯乙酸L.4)制成的琼霜块上培养大约7天（形子开始形 成)。在接种了枯草萝型杆可的胰蛋白藤大豆蛋白酶培养基(1琅脂)的培养基中加入醇面块。并 按上述方法(Barrios-onza'1 ez et al,199动)计算青看素产量。 波态发酵 在含有50al(1×1价)复合生长培养基(S00rs0met,a1,1961)的250ml锥形瓶内，取各菌 株的子接种，在25℃，2500条件下培养36小时，每隔一定时间.取5毫升培养物转接至含有45 复合生产培养基(Sonerson et.a1.1961)的250a1锥形瓶内，作为刷本，在25℃，250m条件下 培养144小时(BarT1o%Gonza1 z et al,1993a),通过对枯草芽孢杆商抗性的生物鉴定米量化其 抗菌素的产量。透过收集推形瓶内所有的培养物并烘干至恒重后测得的生物量表示南能的质量。 团态发醇 先期培养物按照上运方法制备(Barrios-Gonza'1 ez et al.19的3a)。用经过0.3-0.6em孔径箱 过的甘成渣作为无机养料。预处理过的甘氟渣中混入改良的S0rson复合生产培养基，以2×10 孢子/l的浓度接种。初始的水分含量设定为70%：并在每个购山u1t型圆柱发酵罐中加入12固
BamHI-XbaI 消化的 IztapaCos 载体。连接反应用 Gigapack kit（Stratagene），扩增和后期对基因 文库的操作均采用标准化技术。 基因组文库的筛选 将基因组文库置于一个可以计数 30000cfu/dish 的培养皿内，作为一个副本。在两个培养皿中 分别放置一张带正电的尼龙膜（Hybond-N+）（Amersham），用经典方法为杂交做准备。在这两张尼龙 膜上分别用不同的探针进行杂交：一个用 pbcAB 探针，以 TGACAGACTATGTGGGTCTAGACCT 和 CGCTGTAAAGGTAACGCTCTTAAGG 为引物通过 PCR 方法获得，并包括基因 pcbAB 编码区的 3’末端序列和 3’-UTR 的起始序列；另一个使用 penDE 探针，它是一个大小为 0.3kb 的片段，由 HindIII 酶切质 粒 pULJL33（Dı´ez et al.1989）而获得，包含基因 penDE 的 3’末端序列。两种探针都通过切口转 移标记上 α- 32P-dCTP。杂交用的尼龙膜于暗盒中在-70o C 条件下用 Hiperfilm-MP 胶片曝光 1 小时。 真菌的转化 对产黄青霉 Wis 54-1255 npe10、Wis 54-1255 和 P2-32 均按上述方式（Cantoral et al. 1987; Dı´ez et al. 1987）进行转化，用浓度为 30μg/ml 的腐草霉素在 Czapek-Sorbitol（1M）培养基上 筛选转化菌株。用于转化的基因为经碱裂解法由E.coli中提取的40kbp的克隆粘性质粒（见“结果” 部分）。将得到的转化菌株转移到腐草霉素浓度为 30–80μg/ml 的梯度培养基中培养，从而筛选出 高拷贝的转化菌株。 青霉素在琼脂上的产量 将各转化菌株的菌丝体分别接种到改良的 Somerson 培养基（g/l,乳糖 110，葡萄糖 14，CaCO3 20， KH2PO4 6，MgSO4•7H2O 6，谷物浸提液 70，苯乙酸 1.4）制成的琼脂块上培养大约 7 天（孢子开始形 成）。在接种了枯草芽孢杆菌的胰蛋白胨大豆胰蛋白酶培养基（1%琼脂）的培养基中加入琼脂块，并 按上述方法（Barrios-Gonza´lez et al. 1993b）计算青霉素产量。 液态发酵 在含有 50ml（1×106）复合生长培养基（Somerson et.al. 1961）的 250ml 锥形瓶内，取各菌 株的孢子接种，在 25o C,250rpm 条件下培养 36 小时。每隔一定时间，取 5 毫升培养物转接至含有 45ml 复合生产培养基（Somerson et.al. 1961）的 250ml 锥形瓶内，作为副本，在 25o C,250rpm 条件下 培养 144 小时（Barrios-Gonza´lez et al. 1993a）。通过对枯草芽孢杆菌抗性的生物鉴定来量化其 抗菌素的产量。通过收集锥形瓶内所有的培养物并烘干至恒重后测得的生物量表示菌丝的质量。 固态发酵 先期培养物按照上述方法制备（Barrios-Gonza´lez et al. 1993a）。用经过 0.3-0.6mm 孔径筛 过的甘蔗渣作为无机养料。预处理过的甘蔗渣中混入改良的 Somerson 复合生产培养基，以 2×106 孢子/ml 的浓度接种。初始的水分含量设定为 70%；并在每个 Raimbault 型圆柱发酵罐中加入 12g 固
体培养基.发酵过程在25℃条件下进行141小时，通气量设定为2.4L. 取出并混匀圆形容器中的内容物后，取1克潮深的培养基样品测定其阳值和青霉素含量。 将样品在1700a下离心图分钟，青霉素梭抽提到0.1M的隔酸缓冲液中从而使样品的值为 及5（如果有必要可加入H0调节阳值）。取0微升提取物成其稀释物用于生物整定， 数据分析 对干固态和液态发醇实验，实验结果为两个独立实验的平均值。样品（整个培养瓶或圆柱发得 罐)为一式三份。 对原始和转化南株的青霉素产量采用5 todent”sT-test方法进行分析。 (张情) 结果和讨论 我门在粘性质粒载体【xtC0s(图1)中构建了一个基因组文库，该文军携带有一个腐草霜素 抗性基因盒，这个基因可不经进一步的亚克隆而直核转入真菌中。我们的首要目标是分离出一个含 有整套青霉素基因族的粘性质粒克隆，更好的结果则如上所述，利用整套基因核米增加青荐素基因 的将贝数周不是转入单个的pchAB和pcbC-penDE基因(Thei1 gaard et.al.200l): 为实现这一目标，我们已用分别位于基因篾的两个术端的探针CB和eE对基因组文库进 行了筛选〔见“材料与方法”部分)。对E.©01进行的13次克隆证实这两个探针霜已分离出米并获 得了粘性质较NA。以此方式形成的重组粘性质轮雅续呈递进行Souther分析，分析中仍然使用相 月的两个探针以确定它们但含整套的青荷素基因族（图2），其中一个名为【ztaC0s-pen5的粘性 质粒（图2第5列），被用于转化产黄青霜(P,chryse0gemn)。通过与限制图中青霜素基因线区域 的大小进行比较，杂交信号显示至少有7kh的DW存在于IztapsCos-per5的pcb超基因的下游，而 大约2kh的NA存在于penDE基因的下游， 两株P,chryse0ge时n商株is54-1255和P2-3起己被转入粘性质粒IztapaC0spen5。为确保存 在于这种粘性质粒中的青霉素基因截是完整且有功能的，我们增设了对组，即在菌株s5-1255 ©10中也转入该粘性质较以完善实验 转化菌株1s541255和2-忽被转移至高草霜素浓度不断增高的摩脂培界基上，以便选出含有 高将贝数的选择标记基因b1e的菌株，也就是含有高拷贝数青霉素基因族的菌株。转化菌株中的6 株is541255和3株P2-32可以在含有60/ml高草霉素游加剂的培养基上生长。 同时我们利用在琅脂椭上的发爵来检测所有转化菌株的青而素产量。有趣的是，检测中青霉素 产量最高的菌株是对的！/1腐草荷素有抗性的转化商株，我们将此两种菌株中筛选出的青荐素产 量最高的转化两株分别命名为T和P
体培养基。发酵过程在 25 o C 条件下进行 144 小时，通气量设定为 2.4L/h。 取出并混匀圆形容器中的内容物后，取 1 克潮湿的培养基样品测定其 pH 值和青霉素含量。 将样品在 1700rpm 下离心 20 分钟，青霉素被抽提到 0.1M 的磷酸缓冲液中从而使样品的 pH 值为 5.5（如果有必要可加入 H3PO4 调节 pH 值）。取 60 微升提取物或其稀释物用于生物鉴定。 数据分析 对于固态和液态发酵实验，实验结果为两个独立实验的平均值，样品（整个培养瓶或圆柱发酵 罐）为一式三份。 对原始和转化菌株的青霉素产量采用 Student’s T-test 方法进行分析。 （张倩） 结果和讨论 我们在粘性质粒载体 IztapaCos（图 1）中构建了一个基因组文库，该文库携带有一个腐草霉素 抗性基因盒，这个基因可不经进一步的亚克隆而直接转入真菌中。我们的首要目标是分离出一个含 有整套青霉素基因簇的粘性质粒克隆。更好的结果则如上所述，利用整套基因簇来增加青霉素基因 的拷贝数而不是转入单个的 pcbAB 和 pcbC-penDE 基因（Theilgaard et.al.2001）。 为实现这一目标，我们已用分别位于基因簇的两个末端的探针 pcbAB 和 penDE 对基因组文库进 行了筛选（见“材料与方法”部分）。对 E.coli 进行的 13 次克隆证实这两个探针都已分离出来并获 得了粘性质粒 DNA。以此方式形成的重组粘性质粒继续呈递进行 Southern 分析，分析中仍然使用相 同的两个探针以确定它们包含整套的青霉素基因簇（图 2）。其中一个名为 IztapaCos-pen5 的粘性 质粒（图 2 第 5 列），被用于转化产黄青霉（P, chrysogenum）。通过与限制图中青霉素基因簇区域 的大小进行比较，杂交信号显示至少有 7kb 的 DNA 存在于 IztapaCos-pen5 的 pcbAB 基因的下游，而 大约 2kb 的 DNA 存在于 penDE 基因的下游。 两株 P.chrysogenum 菌株 Wis54-1255 和 P2-32 已被转入粘性质粒 IztapaCos-pen5。为确保存 在于这种粘性质粒中的青霉素基因簇是完整且有功能的，我们增设了对照，即在菌株 Wis54-1255 npe10 中也转入该粘性质粒以完善实验。 转化菌株 Wis54-1255 和 P2-32 被转移至腐草霉素浓度不断增高的琼脂培养基上，以便选出含有 高拷贝数的选择标记基因 ble 的菌株，也就是含有高拷贝数青霉素基因簇的菌株。转化菌株中的 6 株 Wis54-1255 和 3 株 P2-32 可以在含有 60μg/ml 腐草霉素添加剂的培养基上生长。 同时我们利用在琼脂鞘上的发酵来检测所有转化菌株的青霉素产量。有趣的是，检测中青霉素 产量最高的菌株是对 60μg/ml 腐草霉素有抗性的转化菌株。我们将此两种菌株中筛选出的青霉素产 量最高的转化菌株分别命名为 TW 和 TP
M 1w11121 23,130 4.361 栅 谢 图2对粘性质粒（来源于基因组文库）的Southern杂交分析显示两个探针（由EcoRI消化） 均为阳性信号。左侧凝胶显示pCh8端探针集杂交结果，右侧凝胶为pD呢端探针膜杂交结果， 我们对液态发醇和战态发醇中V和TP商株的青霉素产量作了仔细检测，并在同一实验中与其 亲本菌株的发醇产量作了比较。在亲本菌株内转入1ztaC0s(空载体)作为对照，该转化商株的 青霉素产量略微低于原菌株的青霉素产量。 相对于亲本商株，转化茵株而和甲的青霉素产量在两种培养体系中均有显著提高。然面。米 源于菌株P2-32的转化南株TP的青每素产量则提高的更多（见表1）。 表1在液老发厚(SF)和固老发醇(SSF)中相比于其亲本菌株，转化酉辣1a541255和 P2-32的青霉素产量的提高率 Snin Femmeatation Penicilin Production y■ production increase(得) (pp'ml or ppde) 4s54-1255 SmF 2%主109 片ea 8±16 TW 1a36±143 SSF 61主624 片etl 103主13T Tw 202±2 2-32 SmF 158±231 片tal 996主106 TP 2574±120 SSF 93±83 Parental 2674士667 P 5159主9 每姐数值均为6次重复实验的平均值士S0,数值b、d、f和h分别显著高于a、G、●和g(根 据Stud知t’8T-t88t,P值分别0.05，。(0.005,0001和<0.001)gd6指每克干培养物
图 2 对粘性质粒（来源于基因组文库）的 Southern 杂交分析显示两个探针（由 EcoRI 消化） 均为阳性信号。左侧凝胶显示 pcbAB 端探针膜杂交结果，右侧凝胶为 penDE 端探针膜杂交结果。 我们对液态发酵和固态发酵中 TW 和 TP 菌株的青霉素产量作了仔细检测，并在同一实验中与其 亲本菌株的发酵产量作了比较。在亲本菌株内转入 IztapaCos（空载体）作为对照，该转化菌株的 青霉素产量略微低于原菌株的青霉素产量。 相对于亲本菌株，转化菌株 TW 和 TP 的青霉素产量在两种培养体系中均有显著提高。然而，来 源于菌株 P2-32 的转化菌株 TP 的青霉素产量则提高的更多（见表 1）。 表 1 在液态发酵（SmF）和固态发酵（SSF）中相比于其亲本菌株，转化菌株 Wis54-1255 和 P2-32 的青霉素产量的提高率 每组数值均为 6 次重复实验的平均值± SD。数值 b、d、f 和 h 分别显著高于 a、c、e 和 g（根 据 Student’s T-test，P 值分别<0.05，<0.005，<0.001 和<0.001） gdc 指每克干培养物
有趣的是，我们注意到在两种培护体系中青霉素产量的提高程度有显若的差别。对于菌株 Wis54-1255而言，同态发酵的青霉素产量提高的要比液态发酵提高的多(67%5.2%，P<0.01)。 对比之下，菌株P2-32液态发醇的青霉煮产量则提高的较多(158%v.93%,P<0.091),在同态发 酵中每克干固体培养物(gdc)中含有51591g的青霉素G,而在液态发酵中为2674ug/ml。 此外，茵株1s54-125的比产量也从730.9士57.2增加至856.9士89.6μg/g干菌丝 (p<0.01),而菌株2-32的则从748.3±68.5增加至1700.1±31.9Pg/g干菌丝(<0.0001). 这一特性在液态发酵中已得到确定，并且表明青霉素产最的加并非由于具有更好的生长状态。 (张品) 我们关于产黄青霉(P.chrygeum)青素产量的早期研充表明微生物在态发酵中的生理 生化反应与在孩态发酵中的大不相同，从而导致了它们在两种培养系统中产量水平的差异。这一信 息指出了设计能够特别适合于周态发酵菌株的改进方法的必要性(Barrios-6o2a1e2etaL.1993a Barrios-Goza'1 ez and Mej1'a007),我们的研究表明越接近于野生型的菌株在固态发酵能越高 效地发挥其青霉素生产潜力，这说明在迪传改良过程中，为适合液态发酵而开发的工业高产陶株 正在失去一些（未知）有助于其在固体培养基上很好地适应和生长的重要功能，(Barrio0sGo如2a'1cz etaL.1993a。寻找这些引起所调的固体培养生理性的“固体培养基因”己成为当前研究的主通 (Barrios-Gonza'lez et al.00:Ishida et al.000:Te Biesebeke et al.2005). 这与我们的实验结果相符，南株1s54-1255比P2-32更接近于野生型。其由于额外拷贝的转 入而导致的在周态发中产量的增加比2-2更高。相反地，对于菌株2-32，额外拷贝的转入则 在液态发酵中起到更加显著的作用。显然，在W5中更加保守的“固态培养基因”促进了其新的生 物合成能力在园态发酵中的发挥，而这些基因在菌株2中没有很好地保留（或激活）。另一项试验 结果也可用相同的原理来解秤，那就是：在同态发酵和液态发醇（培养系统间）中产量水平的整 别在V转化株上更加显著（固态发酵中从49提病到将近100%）而这种别在2转化株上则较小 (固态发酵从168-100%)。 高青霉素滴度产黄青霉工程菌内含有高拷贝的青霉素基因簇，且此高拷贝以中联重复方式排列 (Fierro et al,1995:Ne动crt1997)。到日前为止，通过转入额外青霉素林因拷贝的方式增加青 霉素产量的研究均是在含有单拷贝青霉素基因族的低产菌株上完成的(Veenstra etal.1991 Thci1 ard et al.2001).我门首次使用了P2-32南株，据报道它含有多达14个拷贝的青霉素基因 族(Barrede0etal.199)。Thykaer和Niolsen(203)提出存在子一株陶林内使产量增高的基区 族烤贝数有·个上限：他们指出超过5个考贝之后，基因族将贝数与肯霉素产：量之间不再有线性关 系。我们的实验给果显示即使是2-32这种有高贝青萄基因族的菌株，也是对提高青萄素指 因数量的改进策略高度敏感的
有趣的是，我们注意到在两种培养体系中青霉素产量的提高程度有显著的差别。对于菌株 Wis54-1255 而言，固态发酵的青霉素产量提高的要比液态发酵提高的多（67% vs. 28%，P<0.01）。 对比之下，菌株 P2-32 液态发酵的青霉素产量则提高的较多（158% vs. 93%，P<0.001），在固态发 酵中每克干固体培养物（gdc）中含有 5159 μg 的青霉素 G，而在液态发酵中为 2674 μg/ml。 此外，菌株 Wis54-1255 的比产量也从 730.9 ± 57.2 增加至 856.9 ± 89.6 μg/mg 干菌丝 （P<0.01），而菌株 P2-32 的则从 748.3 ± 68.5 增加至 1700.1 ± 31.9 μg/mg 干菌丝（P<0.0001）。 这一特性在液态发酵中已得到确定，并且表明青霉素产量的增加并非由于具有更好的生长状态。 （张晶） 我们关于产黄青霉( P. chrysogenum )青霉素产量的早期研究表明微生物在固态发酵中的生理 生化反应与在液态发酵中的大不相同，从而导致了它们在两种培养系统中产量水平的差异。这一信 息指出了设计能够特别适合于固态发酵菌株的改进方法的必要性（Barrios-Gonza´lez et al. 1993a; Barrios-Gonza´lez and Mejı´a 2007）。我们的研究表明越接近于野生型的菌株在固态发酵能越高 效地发挥其青霉素生产潜力，这说明在遗传改良过程中，为适合液态发酵而开发的工业高产菌株， 正在失去一些（未知）有助于其在固体培养基上很好地适应和生长的重要功能，（Barrios-Gonza´lez et al.1993a）。寻找这些引起所谓的固体培养生理性的“固体培养基因”已成为当前研究的主题 （Barrios-Gonza´lez et al. 2008; Ishida et al. 2000; Te Biesebeke et al. 2005）。 这与我们的实验结果相符，菌株 Wis 54-1255 比 P2-32 更接近于野生型，其由于额外拷贝的转 入而导致的在固态发酵中产量的增加比 P2-32 更高。相反地，对于菌株 P2-32，额外拷贝的转入则 在液态发酵中起到更加显著的作用。显然，在 Wis 中更加保守的“固态培养基因”促进了其新的生 物合成能力在固态发酵中的发挥，而这些基因在菌株 P2 中没有很好地保留（或激活）。另一项试验 结果也可用相同的原理来解释，那就是 Wis 在固态发酵和液态发酵（培养系统间）中产量水平的差 别在 TW 转化株上更加显著（固态发酵中从 49%提高到将近 100%），而这种差别在 P2 转化株上则较小 （固态发酵从 168-100%）。 高青霉素滴度产黄青霉工程菌内含有高拷贝的青霉素基因簇，且此高拷贝以串联重复方式排列 （Fierro et al. 1995; Newbert 1997）。到目前为止，通过转入额外青霉素基因拷贝的方式增加青 霉素产量的研究均是在含有单拷贝青霉素基因簇的低产菌株上完成的（Veenstra et al. 1991; Theilgaard et al.2001）。我们首次使用了 P2-32 菌株，据报道它含有多达 14 个拷贝的青霉素基因 簇（Barredo et al. 1989）。Thykaer 和 Nielsen（2003）提出存在于一株菌株内使产量增高的基因 簇拷贝数有一个上限；他们指出超过 5 个拷贝之后，基因簇拷贝数与青霉素产量之间不再有线性关 系。我们的实验结果显示即使是 P2-32 这种有着高拷贝青霉素基因簇的菌株，也是对提高青霉素基 因数量的改进策略高度敏感的
如前所述，P2-2转化株在液态发酵和态发脖中均比5~1255转化株显示出史高的青香 素产量的培加（相比于其亲本菌株）》。对这些结果有种与生物合成基因无关的解释。P2是一个不顺 经过突变和筛选而得的高青霉素产量株，这意味着它已经积紫了很多突变，而很多这些突变在功 能上与生物合成基因不同但可以互补（附属基因），比如更高的拾出能力。很多这类基因已被描述 (Kiel et al.2005:Lanas--aceiras etal.2006;Garc1a--Rico et al.2008).这些交变使得 更高的青霉素生物合成潜能得列更好地表达《由于生物合成基因的扩增)。因此，已存在于南株 中的互补突变必定使得菌株对通过增如青霉素基因族考贝数后获得的更高的生物合成潜能进行更高 效的利用。 另外，本实验首次显示基因剂最的增加对因态发酵中次级代谢物产录的提高也同样适用：在这 点上，可以预见本实验中提出的策略在其最有效的形式下，也可用于其它更适用于因态发醇的实验， 如B1 rrios-Gza'1 ez et al..(1993)和Ban"o5etl.(2007)描述的那些。 综上，我们的试验结果表明，不论对低产或高产的林，尽管后者已经含有高转贝的青霉素 因族，扩增青霉素基因pcbAB--pCbC-penDE的数量均会使茵株在液态发酵和固态发静中的产量得到指 高 参考文献（略） 本文由张蕊，张情，张品，形跃四位同学翻详完成，文中已将每人翻译各分标出
如前所述，P2-32 转化株在液态发酵和固态发酵中均比 Wis 54-1255 转化株显示出更高的青霉 素产量的增加（相比于其亲本菌株）。对这些结果有种与生物合成基因无关的解释。P2 是一个不断 经过突变和筛选而得的高青霉素产量菌株。这意味着它已经积累了很多突变，而很多这些突变在功 能上与生物合成基因不同但可以互补（附属基因），比如更高的输出能力。很多这类基因已被描述 （Kiel et al. 2005; Lamas-Maceiras et al. 2006; Garcı´a-Rico et al. 2008）。这些突变使得 更高的青霉素生物合成潜能得到更好地表达（由于生物合成基因的扩增）。因此，已存在于菌株 P2 中的互补突变必定使得菌株对通过增加青霉素基因簇拷贝数后获得的更高的生物合成潜能进行更高 效的利用。 另外，本实验首次显示基因剂量的增加对固态发酵中次级代谢物产量的提高也同样适用。在这 点上，可以预见本实验中提出的策略在其最有效的形式下，也可用于其它更适用于固态发酵的实验， 如 Barrios-Gonza´lez et al. (1993a)和 Ban˜os et al. (2007)描述的那些。 综上，我们的试验结果表明，不论对低产或高产的菌株，尽管后者已经含有高拷贝的青霉素基 因簇，扩增青霉素基因 pcbAB-pcbC-penDE 的数量均会使菌株在液态发酵和固态发酵中的产量得到提 高。 参考文献（略） 本文由张蕊，张倩，张晶，邢跃四位同学翻译完成，文中已将每人翻译各部分标出