利用微卫星多重螺和带型分新鉴别雕清牌母菌株 摘要 我们提出了一种利用多重R对微卫星位点多老性分析快速鉴别酸酒酵母药种的方法。 无需使用苯酚，简单提取体A,利用多重CR扩增S8132L,OR267C和SCPT57位点，用琼脂糖和 聚丙烯酰酸凝胶电泳进行带型分析，这种方法可使我们区分即种商用葡萄清酸清商种。该方法被成功应 用于一项在15和20摄氏度这两个发酵温度下检验两个面株间的显性关系的生态学研究中。 这种方法在酸酒和酵母生产工业中常规的低成本检测酵母两株的过程中应该有应用价值。 关健问：微卫星，CR,酵母菌株，葡萄酒，发酵 1.前言 使用速育出的用于酒精发酵的酵母南株酸造葡萄酒是现在普治使用的一种方法。酵厚对葡面酒的质量 尤其是口味有很大的影响( 现代的酿清学家发现用不同的酵母菌株发醇可以使葡萄酒产生不料的特点。这导致了具有多种特色并 可以应用于不同额城的速有商株工业生产化。现在市场上提供了几百种葡面酒南种，它们几乎都属于酿酒 酵母商属。 与此同时，人门对发明快速而且精确检测酵母菌株的方法也产生了兴理。在葡萄清酿迹中，它的应用 包括确定接种茵株对在未发酵葡面汁中野生菌株的显性优势，实时记承发酵中的茵株动态过程，控制丙株 生产的质量并鉴别无效菌株，酿酒时，选育出的菌株被接种于富含野生酿酒酵母和丰酿酒酵母的笔萄汁中。 快速鉴别酵母菌株的方法应该考虑到南群生长动古的观察。选育南株的显性优势和环境因素对醇母蘭株的 影响。在葡萄清发解，温度是影响酵母动力学的一个主要因素(F1 eet and Heard,,1993):生态研究也显 示出了酸酒酵母南株的不同行为。低pifanio et al.,1S99:Torijaet al.,200). 事实上，酿酒商要求药株的一个突出特点是能够在特定的温度下进行良好的发酵反应。 很多时候，在一个具型的发解白葡萄，发解温度应保特18摄民度，但达到2-15摄氏度也不少见， 从而提高测味品酯的含量并减少高清精形成。在此温度下，经常会发生发酵停滞。因此，在这种状况下， 选育西种的低温代谢能力和对野生商种的显性促势备受重视。 在过去的几年中，研究侧重于用分子生物学方法进行菌株分化(Beh et al.,2006),如染色体分 析法(Carle and0lson,1985:Blondin and Vezinhet,198g)和限制性片段长度多态性(P）分析 mWA(Querolet al..,1992》,以及基于PCR的方法，其中包括内部转录序列(ITS》的核糖体NA测 序(Montrocher et al.,1998)，8元件插入位点的多态性(Cameroe et al.,1979:ess et al..,1993), 扩增片段长度多态性(P)的(De Barros L0 pes et al..,19的的)，随机扩增多志性NA(RAPD)
利用微卫星多重 PCR 和带型分析鉴别酿酒酵母菌株 摘要 我们提出了一种利用多重 PCR 对微卫星位点多态性分析快速鉴别酿酒酵母菌种的方法。 无需使用苯酚，简单提取 DNA，利用多重 PCR 扩增 SC8132X, YOR267C 和 SCPTSY7 位点，用琼脂糖和 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行带型分析，这种方法可使我们区分 30 种商用葡萄酒酿酒菌种。该方法被成功应 用于一项在 15 和 20 摄氏度这两个发酵温度下检验两个菌株间的显性关系的生态学研究中。 这种方法在酿酒和酵母生产工业中常规的低成本检测酵母菌株的过程中应该有应用价值。 关键词：微卫星，PCR，酵母菌株，葡萄酒，发酵 1.前言 使用选育出的用于酒精发酵的酵母菌株酿造葡萄酒是现在普遍使用的一种方法。酵母对葡萄酒的质量 尤其是口味有很大的影响（ 现代的酿酒学家发现用不同的酵母菌株发酵可以使葡萄酒产生不同的特点。这导致了具有多种特色并 可以应用于不同领域的选育菌株工业生产化。现在市场上提供了几百种葡萄酒菌种，它们几乎都属于酿酒 酵母菌属。 与此同时，人们对发明快速而且精确检测酵母菌株的方法也产生了兴趣。在葡萄酒酿造中，它的应用 包括确定接种菌株对在未发酵葡萄汁中野生菌株的显性优势，实时记录发酵中的菌株动态过程，控制菌株 生产的质量并鉴别无效菌株。酿酒时，选育出的菌株被接种于富含野生酿酒酵母和非酿酒酵母的葡萄汁中。 快速鉴别酵母菌株的方法应该考虑到菌群生长动态的观察，选育菌株的显性优势和环境因素对酵母菌株的 影响。在葡萄酒发酵，温度是影响酵母动力学的一个主要因素（Fleet and Heard,1993）;生态研究也显 示出了酿酒酵母菌株的不同行为。(Epifanio et al., 1999; Torijaet al., 2003). 事实上，酿酒商要求菌株的一个突出特点是能够在特定的温度下进行良好的发酵反应。 很多时候，在一个典型的发酵白葡萄，发酵温度应保持 18 摄氏度，但达到 12-15 摄氏度也不少见， 从而提高调味品酯的含量并减少高酒精形成。在此温度下，经常会发生发酵停滞，因此，在这种状况下， 选育菌种的低温代谢能力和对野生菌种的显性优势备受重视。 在过去的几年中，研究侧重于用分子生物学方法进行菌株分化（Beh et al., 2006） ，如染色体分 析法（Carle and Olson,1985; Blondin and Vezinhet, 1988）和限制性片段长度多态性（ RFLP ）分析 mDNA （Querolet al., 1992） ，以及基于 PCR 的方法，其中包括内部转录序列（ ITS ）的核糖体 DNA 测 序（Montrocher et al., 1998） ，δ元件插入位点的多态性（Cameron et al., 1979;Ness et al., 1993） ， 扩增片段长度多态性（ AFLP ）的（De Barros Lopes et al., 1999） ，随机扩增多态性 DNA （ RAPD ）
(Baleiras--Couto et al.,1996),内含子剪接序列扩增(De Barros Lopes etaL.,1996)及PCR内含的线轮体基因(o'pez et al..,2003), 这些方法在关于分辨率和处理时何方面对经典生理学实验起到了增强作用，但是其中一些方法还有些 限制条件，因为它们几乎不能应用于日常的分析中，或者当它们容易实随时，它们并不能在菌种水平上完 全区分这些商床。此外，在一些方法中，如5元件分型和AD,其重观性取决于N核版的纯度和浓度。 Ferna’ndez-Espinar et al.,2001;Beh et al.,2006).这些缺点意味着花费大量时间和货金进行 NA清理步豫。在某些情况下还需要几步反应，以评估重复性带型发生的可能性。 基于具有长度多老性的蔺单序列重复基因位点分散在整个基因组中，微卫星分析己咸功地核用来区分 (Field and Wills.1998:Gonzalex Techera et al..2001:Pe'rex et al.,2001;Hennequin etal.,200l:Malgoire et a1.,2005)。最近，利用对具高夜多态性的微卫星位点的多重PCR方法可以 分离一系列商用酵母丙株(Schul1 er et al.,2004:Bradbury et al.,2005:Lera8etal,2005). 微卫星位点代C闲高拼别能力以及其稳定性和实用性使其成为区分酵母菌种最受欢迎的方法之一。这个方法 用干常规检测的瓶颈发生在扩增子分析的步裸：利用聚丙烯酰酸凝校及测序分析仪确定扩增子的大小较为 贵时费力。为了避免这个限制。有人提出利用简单的高张力琅琼脂糖凝胶电沐（知tman and Cheverud. 1994:Ferraro et al.,199g),最近，ael1等人(2004)建i议利用对SC81325位点的0R扩增和聚丙 烯酰胶凝胶加B染色电泳来进行酸消酵母的分型。 为了建立一种快速精确并且甚至适用于那些低预算高通量实验室的鉴别茵种的方法，我门对3个高多 态性微卫星位点的多重扩增(Gonzalez Techera et al.,2001),然后用琼脂糖凝胶电泳进行带型分析。 作为第一步。我们对一组9种商用酵母商株进行测试，另加一酸酒醇母菌株作为参考，以检查该方 法的鉴别能力。然后，我们门在测试发酵温度对共接种的两个选育两株的生长速率和竞争能力的影响的实验 中校查了这种方法的实际适用性。 2材料与方法 21酵母菌株和培养基 酸清酵母菌株采购于酸清酵母生产商。酸消醇母菌株见表1。醇母菌模式菌株(CS1171)从 CRA-Istituto Sperimentale per1”Enologia of Asti,Italy(ISE)的收集品中获得. 商用干南株是浮于无菌5筑的莲糖液体培养基中，40摄民度下放置30分钟，稀释，然后涂布于A平 板(10x/1.葡萄糖。5/L蛋白膝3g/L酵母浸出物，3gL.麦号膏和20g/L琼脂)，然后在24摄氏度下培 养48小时， 22NA轴提 在第一步检验这种方法的鉴别能力时，我门用HarJ加等人(2004)的方法抽提体A。简单的说，将单
（Baleiras-Couto et al., 1996） ， 内含子剪接序列扩增（De Barros Lopes et al., 1996）及 PCR 内含的线粒体基因（Lo′ pez et al., 2003） 。 这些方法在关于分辨率和处理时间方面对经典生理学实验起到了增强作用，但是其中一些方法还有些 限制条件，因为它们几乎不能应用于日常的分析中，或者当它们容易实施时，它们并不能在菌种水平上完 全区分这些菌株。此外，在一些方法中，如δ元件分型和 RAPD，其重现性取决于 DNA 模板的纯度和浓度。 (Ferna′ ndez-Espinar et al., 2001; Beh et al., 2006)。这些缺点意味着花费大量时间和资金进行 DNA 清理步骤，在某些情况下还需要几步反应，以评估非重复性带型发生的可能性。 基于具有长度多态性的简单序列重复基因位点分散在整个基因组中，微卫星分析已成功地被用来区分 酵母菌株（Field and Wills, 1998;Gonzalez Techera et al., 2001; Pe′rez et al., 2001;Hennequin et al., 2001; Malgoire et al., 2005）。最近，利用对具高度多态性的微卫星位点的多重 PCR 方法可以 分离一系列商用酵母菌株 (Schuller et al., 2004;Bradbury et al., 2005; Legras et al., 2005)。 微卫星位点 PCR 高辨别能力以及其稳定性和实用性使其成为区分酵母菌种最受欢迎的方法之一。这个方法 用于常规检测的瓶颈发生在扩增子分析的步骤：利用聚丙烯酰胺凝胶及测序分析仪确定扩增子的大小较为 费时费力。为了避免这个限制，有人提出利用简单的高张力琼脂糖凝胶电泳（Routman and Cheverud, 1994;Ferraro et al., 1998) 。最近，Howell 等人（2004）建议利用对 SC8132X 位点的 PCR 扩增和聚丙 烯酰胺凝胶加 EB 染色电泳来进行酿酒酵母的分型。 为了建立一种快速精确并且甚至适用于那些低预算高通量实验室的鉴别菌种的方法，我们对 3 个高多 态性微卫星位点的多重扩增（Gonzalez Techera et al., 2001），然后用琼脂糖凝胶电泳进行带型分析。 作为第一步，我们对一组 29 种商用酵母菌株进行测试，另加一酿酒酵母菌株作为参考，以检查该方 法的鉴别能力。然后，我们在测试发酵温度对共接种的两个选育菌株的生长速率和竞争能力的影响的实验 中检查了这种方法的实际适用性。 2.材料与方法 2.1 酵母菌株和培养基 酿酒酵母菌株采购于酿酒酵母生产商。酿酒酵母菌株见表 1。酵母菌模式菌株（CBS 1171）从 CRA-Istituto Sperimentale per l’Enologia of Asti, Italy (ISE)的收集品中获得。 商用干菌株悬浮于无菌 5%的蔗糖液体培养基中，40 摄氏度下放置 30 分钟，稀释，然后涂布于 YMA 平 板(10g/L 葡萄糖, 5g/L 蛋白胨, 3g/L 酵母浸出物, 3g /L 麦芽膏和 20g/ L 琼脂),然后在 24 摄氏度下培 养 48 小时。 2.2 DNA 抽提 在第一步检验这种方法的鉴别能力时，我们用 Harju 等人（2004）的方法抽提 DNA。简单的说，将单
个药落重是浮于200al的1ysi8 buffer(2(/)TritonX-100.1s(e/)S06,100olL1NC1.10 molL1Tris-C1州8.0,1olL1可Ap出8.0)中。这些试管放置于-80度冰箱中3分钟（直到完 全冻住)，然后在96摄氏度下于Thermcaixer(Eppendorf AG,laabura,Gernany)中放置一分钟（不要 服荡)使它们快速溶化。重复上述过程，然后以最大速度旋转试管30秒。向试管中加入200l氧传冰溶， 然后振荡试管2分钟，20,000%，5摄氏度的条件下离心5分钟。取上清液与另一试管中加入4001冰的 纯乙醇，20摄氏度下静置沉淀10分钟，经后在0,000g,5摄氏度下离心10分钟。去上清，WA沉淀 用05L70%《w/w)乙醇纯化，5摄民度下真空干燥。得到的幅溶于15alTE(10olL1Tris,1ol 1,1DTA,80)。第二步检验该方法适用性的过程中，用微量加样吸头直接从单商落中提取菌体直接 悬浮于事先加好黑混合物的a,2ml孔中。 23.CR与电泳 三个微卫星位点，SC8132区，℃R267C和SCPTSY7被使用是由干他门具有高度的多态性。扩增是依赖于 几对特异性的顺式与反式的引物进行的（见表二）SC8132四位点的引物与0球287汇位点的顺式引物是由 Field和i11s所设计的，YO家267式位点的反式引物是由Gonzale2 Techera et al制作的，而SCPTSY7位 点的顺式引物是由Perex et al制作的。SCPTS7位点的反式引物是由我们使用免贵款件Priner3所设计 的，目的是使其产生几个电林带具有明暴位置区别的扩增子而不与其他两个位点重叠。 R扩增是进行在一个具有20微升体积液体的Biorad MyCye1er热力周期仪中。20微升液体是有以 下都分组成的：1微升N的萃取溶液（包含20-0mgA),31rolL浓度的sCl,0ol/L浓度的 各种dNTP,2微升去镁的PCR缓冲液，2个单位Taq DNA聚合例，SCYO267C位点引物各10pol,SC8132X 位点引物各15即o】以及SCPTSY7位点的引物各0即©l.CR反应组分各成分的浓度被设计得尽量诚小非 特异性扩增。在发醇实验中，反应体系的体积为10微升，试剂组分与所占比例与上述反应体系相同，这 样做可以节者Tg案合酶与其他昂贵的试剂。为了优化对三个位点的多元化扩增，方案如下：94℃保持4 分钟，以立94℃保持30秒：b.56℃保特45秒：c.72℃保持30秒为一个周期，重复8个周期，最后以72℃ 保持10分钟处理。 将产物在尺寸为15*10浓度为2.5路《/y)的琼脂椰凝胶上，浸于TE援冲液中，在100N条件下电 泳80分钟，凝较将被溴化乙锭所染色.当使用聚丙烯酰技凝胶电泳时，应使用预制的8.66.8c10%(s/y) 的TE配凝胶，在100W条件下电读0分钟，场kcr应使用标记分子量为100-2Ohp的s1阶rker, 电法分布情况被集群分析软件处理，该载件使用一种类似于二进制的番标，它使用心M的方式创建 系统树图。月表象相关性将被用于探知由ossetti和Giraffa描述的确定的与非确定的聚类。问表项相 关性的百分比在各个分支中给出， 2.4该方法的可重复性与微卫星标记的稳定性
个菌落重悬浮于 200ml 的 lysis buffer(2% (w/v) TritonX-100, 1% (w/v) SDS, 100 mmol L_1 NaCl, 10 mmol L_1Tris–HCl pH 8.0, 1 mmol L_1 EDTA pH 8.0)中。这些试管放置于-80 度冰箱中 3 分钟（直到完 全冻住），然后在 95 摄氏度下于 Thermomixer（Eppendorf AG, Hamburg, Germany）中放置一分钟（不要 振荡）使它们快速溶化。重复上述过程，然后以最大速度旋转试管 30 秒。向试管中加入 200ml 氯仿冰浴， 然后振荡试管 2 分钟，20，000g ，5 摄氏度的条件下离心 5 分钟。取上清液与另一试管中加入 400ml 冰的 纯乙醇，20 摄氏度下静置沉淀 10 分钟，然后在 20，000g ，5 摄氏度下离心 10 分钟。去上清，DNA 沉淀 用 0.5mL 70% (v/v)乙醇纯化，45 摄氏度下真空干燥。得到的 DNA 溶于 15mlTE (10 mmol L_1 Tris, 1 mmol L_1 EDTA, pH 8.0)。第二步检验该方法适用性的过程中，用微量加样吸头直接从单菌落中提取菌体直接 悬浮于事先加好 PCR 混合物的 0.2ml 孔中。 2.3 .PCR 与电泳 三个微卫星位点，SC8132X,YOR267C 和 SCPTSY7 被使用是由于他们具有高度的多态性。扩增是依赖于 几对特异性的顺式与反式的引物进行的（见表二）SC8132X 位点的引物与 YOR267C 位点的顺式引物是由 Field 和 Wills 所设计的，YOR267C 位点的反式引物是由 Gonzalez Techera et al 制作的，而 SCPTSY7 位 点的顺式引物是由 Perez et al 制作的。SCPTSY7 位点的反式引物是由我们使用免费软件 Primer 3 所设计 的，目的是使其产生几个电泳带具有明显位置区别的扩增子而不与其他两个位点重叠。 PCR 扩增是进行在一个具有 20 微升体积液体的 Biorad MyCycler 热力周期仪中。20 微升液体是有以 下部分组成的：1 微升 DNA 的萃取溶液（包含 20-40ng DNA），3.1mmol/L 浓度的 MgCl2，0.4mmol/L 浓度的 各种 dNTP,2 微升去镁的 PCR 缓冲液，2 个单位 Taq DNA 聚合酶，SCYOR267C 位点引物各 10pmol，SC8132X 位点引物各 15pmol 以及 SCPTSY7 位点的引物各 40pmol。PCR 反应组分各成分的浓度被设计得尽量减小非 特异性扩增。在发酵实验中，反应体系的体积为 10 微升，试剂组分与所占比例与上述反应体系相同，这 样做可以节省 Taq 聚合酶与其他昂贵的试剂。为了优化对三个位点的多元化扩增，方案如下：94℃保持 4 分钟，以 a.94℃保持 30 秒;b.56℃保持 45 秒;c.72℃保持 30 秒为一个周期，重复 28 个周期，最后以 72℃ 保持 10 分钟处理。 将产物在尺寸为 15*10cm2 浓度为 2.5%（w/v）的琼脂糖凝胶上，浸于 TBE 缓冲液中，在 100V 条件下电 泳 80 分钟，凝胶将被溴化乙錠所染色。当使用聚丙烯酰胺凝胶电泳时，应使用预制的 8.6*6.8cm2 10%(w/v) 的 TBE 凝胶，在 100V 条件下电泳 60 分钟。Marker 应使用标记分子量为 100-20bp 的 Sigma 低阶 marker。 电泳分布情况被集群分析软件处理，该软件使用一种类似于二进制的指标，它使用 UPGMA 的方式创建 系统树图。同表象相关性将被用于探知由 Rossetti 和 Giraffa 描述的确定的与非确定的聚类。同表项相 关性的百分比在各个分支中给出。 2.4.该方法的可重复性与微卫星标记的稳定性
通过对每个菌株取五份菌落W(萃取液进行扩增来检测呵重复性，对扩增产物的分析是将其分为五个 不同孔道进行琼脂糖电冰而选行的， 为了检验微卫星标记在清精发醇中的稳定性，检险是在随意挑选的三个首株中进行的：菌株2，菌株 3和百株5。再水化后，每个菌株核单独接种在整有灭茵随萄汁的500阳1烧瓶中。在16℃的条件下发醇20 天。 表二用于扩增的三株牌酒解母微卫星位点引物 分析在十组随意选出的商落中选行，这些药落取自发酵开始时和结束时的每个茵株。 25.发解 两株酵母菌株，SM Cepage Chardonnay和Vitilevure DV10被选中进行发酵试验，因为他们具有相 似的用途与特征（用于白葡萄发醇，醇耐受性和表型杀伤性相似），就像制造者说的一样，V1t1vure防10 是耐冷的。 灭菌的葡萄汁被用于培养基.它包含浓度均为150g/L的确酸铵和磷酸铵作为发酵氮源.浓度为200g/L 的花糖被加入作为糖源， 发酵开始封将1，乩灭菌的菌萄汁加入到容积为L的带有感力视拌器的惟形烧瓶中。这个仪器以一个 有孔的橡皮塞封口，有一根以棉线周定的巴斯德吸管扬在孔中。 以单菌株涂平板，再挑出单亩落以多元的服分析方法检测它门的同一性。然后将相同的菌落悬浮培 养于预配的培养基中，该培养基由灭菌的菌萄汁组成，可以提供氨源但无糖源。 在0℃下进行每分钟质动100次的好氧生长后，形成混合的接种物，每个药株都具有均一的浓度，为 5体10个细照/L。由末度为1率1心个细围入的单南株形成的接种物用来检测每种南株完成发卧的能力。发酵 湿度被控制在15一20℃之间，并且设有条件相月的对照组。 样本被取于每个两株发醇过程中的的相同时间，这几个时间点分别为：发酵开始时（接种后的十分钟）， 葡萄汁中残余0，糖分时，葡萄汁中残余30%糖分时以及发耐结束时(2g/几)。发酵过程中糖分浓度是由 高性能液体色语校测的，使用一根KC豪乙烯圆柱棒与一个折光指数检测器。 将样品稀释并涂布于A平板培养基上。在25℃下培养48小时后，将含有茵落数为150-200的商落 随机挑速进行CR分析。在每个时间点，每个菌落分析4860个菌落。总共900个菌落被检测。 3结果 31酵母菌菌株分类 图.1为隙脂糖凝胶电泳结果。对于每一菌株，除了最明显的一条电沐带外，还观察到好几条核制的带， 可能是因为丰特异性扩增。将单一引物扩增的带形图和多引物书扩增带形图比较发现19和30（菌株）的电 泳图中有大量的这些带。图2中，这些微露的带同样出现在由单一引物选行扩增的带形图中，说明不是由
通过对每个菌株取五份菌落 DNA 萃取液进行扩增来检测可重复性，对扩增产物的分析是将其分为五个 不同孔道进行琼脂糖电泳而进行的。 为了检验微卫星标记在酒精发酵中的稳定性，检验是在随意挑选的三个菌株中进行的：菌株 2，菌株 3 和菌株 5。再水化后，每个菌株被单独接种在盛有灭菌葡萄汁的 500ml 烧瓶中。在 16℃的条件下发酵 20 天。 表二 用于扩增的三株啤酒酵母微卫星位点引物 分析在十组随意选出的菌落中进行，这些菌落取自发酵开始时和结束时的每个菌株。 2.5.发酵 两株酵母菌株，DSM Cepage Chardonnay 和 Vitilevure DV10 被选中进行发酵试验，因为他们具有相 似的用途与特征（用于白葡萄发酵，醇耐受性和表型杀伤性相似），就像制造者说的一样。Vitilevure DV10 是耐冷的。 灭菌的葡萄汁被用于培养基。它包含浓度均为150mg/L的硫酸铵和磷酸铵作为发酵氮源。浓度为200g/L 的蔗糖被加入作为糖源。 发酵开始时将 1.6L 灭菌的葡萄汁加入到容积为 2L 的带有磁力搅拌器的锥形烧瓶中。这个仪器以一个 有孔的橡皮塞封口，有一根以棉线固定的巴斯德吸管插在孔中。 以单菌株涂平板，再挑出单菌落以多元的 PCR 分析方法检测它们的同一性。然后将相同的菌落悬浮培 养于预配的培养基中，该培养基由灭菌的葡萄汁组成，可以提供氮源但无糖源。 在 20℃下进行每分钟震动 100 次的好氧生长后，形成混合的接种物，每个菌株都具有均一的浓度，为 5*105 个细胞/L。由浓度为 1*106 个细胞/L 的单菌株形成的接种物用来检测每种菌株完成发酵的能力。发酵 温度被控制在 15-20℃之间，并且设有条件相同的对照组。 样本被取于每个菌株发酵过程中的的相同时间，这几个时间点分别为：发酵开始时（接种后的十分钟）， 葡萄汁中残余 60%糖分时，葡萄汁中残余 30%糖分时以及发酵结束时（<2g/L）。发酵过程中糖分浓度是由 高性能液体色谱检测的，使用一根 OAKC 聚乙烯圆柱棒与一个折光指数检测器。 将样品稀释并涂布于 YMA 平板培养基上。在 25℃下培养 48 小时后，将含有菌落数为 150-200 的菌落 随机挑选进行 PCR 分析。在每个时间点，每个菌落分析 48-60 个菌落。总共 900 个菌落被检测。 3.结果 3.1 酵母菌菌株分类 图.1 为琼脂糖凝胶电泳结果。对于每一菌株，除了最明显的一条电泳带外，还观察到好几条模糊的带， 可能是因为非特异性扩增。将单一引物扩增的带形图和多引物扩增带形图比较发现 19 和 30（菌株）的电 泳图中有大量的这些带。图 2 中，这些微弱的带同样出现在由单一引物进行扩增的带形图中，说明不是由
3个位点的引物的交互作用引起的，尽管这些蕾是可复制的，但是它们并不被认为有基因多态性价值。 各片断在数量和大小上的差异已被发现。对千1、3、4、6、8、10、11.15、20、24和25这些商株， 仅有3条比较明显的带出现，然面大都分菌株显示，电袜图中每个位点出现3到9条蒂面不是1到3条带， 箭形图的电脑分析显示，在所有的菌株里面，3与7,18与29、8与20、14与16有80%以上相似， 仅在带宽上有很小的差异，同时2与9、4与1山茵有10信的相似度。所有有80叭以上相似度的组群导致可 靠的100汽可表象相关。为了核实这些结果，将CR得到的产物的1%聚丙烯酰技凝胶电泳结果和琼霜糖凝 胶电辣结果进行比较（图.4），电冰结果（图.4》最示：18与29、8与20、14与16展现出在电泳管数量 和位置方面的清晰而有价值的差异：3与7,4与8的结果非常相似，但是，可通过用SCPTSY7引物对3于 7进行扩增产生的扩增子和用5CT5Y7与5C8132红引物对4与7进行扩增产生的扩增子进行区别. 最后，DSM Fermivin(菌株2)和山affort Zymaf1oeST(茵株9)在所有的电冰分析中显示相月的 结果。 在重复实验中，对任一菌株的五个重复试验结果显示出相同的带形图，用Bionunerics软件分析各片 断大小与平均值的标准偏差不超过1.5%（图.3），达到100%匹配。 在发醇开始和结束时树3个所挑选菌株的扩增，产生相同的轮廓，说明在发醇过程中微卫星标记是整 定的。 3.2发解 在发酵试险中，通过对采集和重悬的细程群落直接进行CR与用冷谦草取法提取麻A后扩赠所得到的 带形没有差别。得到的带都很清南，而且所用的两个菌株的差别根明显。蛋白质和细胞组分干扰信号会很 快地消失。不会影响到的迁移。 由两个南株发解试验所得到的结果知图6所示。在15℃试验中，。菌株5再发酵中很快占暴优劳：当 3的糖分核消耗后，该南株在整个南群中的百分比达到70%，在发酵结束时，面株3己基本消失（图.6a)。 在20℃发酵中（图.伪）两个商株的行为是不同的。在实验上半过程中，他们互具促势，而在以后的 发酵过程中南株5的数量增加。当糖分全部消耗后，菌株5再整个南屏中占的比例达到50%。 4、讨论 虽然允许对扩增子的精确测定的分析序列，仍然是菌株的微指令卫星分型的参考标准。但品贵的成本 和有限的产量是它在酒类研究领域中得以日常应用的障得。我们基于对由多元家产生的样本的分析面提 出的方法是有讲识力和分析及成本的时间需要两者的好的折中。 我们能够区分30种大量生产的检测过的商株其中的9种。幕种与琅脂糖电法相似的菌株可以进一步 分析和被聚丙烯酰胺预制的凝胶体区别。只有2种一一SM Feraivin和Laffort Zymaf1oreS缸，是瑰脂糖 和聚丙解酰胶顶制的凝胶体均不能加以区分的
3 个位点的引物的交互作用引起的，尽管这些带是可复制的，但是它们并不被认为有基因多态性价值。 各片断在数量和大小上的差异已被发现。对于 1、3、4、6、8、10、11、15、20、24 和 25 这些菌株， 仅有 3 条比较明显的带出现，然而大部分菌株显示，电泳图中每个位点出现 3 到 9 条带而不是 1 到 3 条带。 带形图的电脑分析显示，在所有的菌株里面，3 与 7、18 与 29、8 与 20、14 与 16 有 80%以上相似， 仅在带宽上有很小的差异，同时 2 与 9、4 与 11 菌有 100%的相似度。所有有 80%以上相似度的组群导致可 靠的 100%同表象相关。为了核实这些结果，将 PCR 得到的产物的 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果和琼脂糖凝 胶电泳结果进行比较（图.4）。电泳结果（图.4b）显示：18 与 29、8 与 20、14 与 16 展现出在电泳带数量 和位置方面的清晰而有价值的差异。3 与 7、4 与 8 的结果非常相似，但是，可通过用 SCPTSY7 引物对 3 于 7 进行扩增产生的扩增子和用 SCPTSY7 与 SC8132X 引物对 4 与 7 进行扩增产生的扩增子进行区别。 最后，DSM Fermivin（菌株 2）和 Laffort Zymaflore ST（菌株 9）在所有的电泳分析中显示相同的 结果。 在重复实验中，对任一菌株的五个重复试验结果显示出相同的带形图，用 Bionumerics 软件分析各片 断大小与平均值的标准偏差不超过 1.5%（图.3），达到 100%匹配。 在发酵开始和结束时对 3 个所挑选菌株的扩增，产生相同的轮廓，说明在发酵过程中微卫星标记是稳 定的。 3.2 发酵 在发酵试验中，通过对采集和重悬的细胞群落直接进行 PCR 与用冷冻萃取法提取 DNA 后扩增所得到的 带形没有差别。得到的带都很清晰，而且所用的两个菌株的差别很明显。蛋白质和细胞组分干扰信号会很 快地消失，不会影响到 DNA 的迁移。 由两个菌株发酵试验所得到的结果如图.6 所示。在 15℃试验中，菌株 5 再发酵中很快占据优势；当 30%的糖分被消耗后，该菌株在整个菌群中的百分比达到 70%，在发酵结束时，菌株 3 已基本消失（图.6a）。 在 20℃发酵中（图.6b）两个菌株的行为是不同的。在实验上半过程中，他们互具优势，而在以后的 发酵过程中菌株 5 的数量增加。当糖分全部消耗后，菌株 5 再整个菌群中占的比例达到 85%-90% 。 4、讨论 虽然允许对扩增子的精确测定的分析序列，仍然是菌株的微指令卫星分型的参考标准，但昂贵的成本 和有限的产量是它在酒类研究领域中得以日常应用的障碍。我们基于对由多元 PCR 产生的样本的分析而提 出的方法是有辨识力和分析及成本的时间需要两者的好的折中。 我们能够区分 30 种大量生产的检测过的菌株其中的 29 种，那种与琼脂糖电泳相似的菌株可以进一步 分析和被聚丙烯酰胺预制的凝胶体区别。只有 2 种——DSM Fermivin 和 Laffort Zymaflore ST,是琼脂糖 和聚丙烯酰胺预制的凝胶体均不能加以区分的
最近，利用17多形志标记对以上2种商株的遗传分析显示，它们仅在第4位点有经微的不同（包括 SC8132红)。SC8132x位点表明，在这个研究中，D5 M Fermivin的1个等位基因和Laffort Zymaf1 ore ST 的2个等位基因在4北即被识别。这个重要的区别应该按琼脂糖和聚丙烯酰胺预制的凝敢体二者之一区别。 然而，我们的分析，表明2种菌株总体上在扩增子的数量及大小SC813心扩增中区别很小。这个争论可能 因为在许多不同酵母生产过程中的变异引起的一个小的遗传差异。令1个假设是醇母生产者在不同的市 场上用了同1个商业名称出售2种酵母商株。 有整的是，一些国株给出了很多强烈的带。当每个位点的梦的数目多于1个时，这可能是因为倍数染 色体位点杂合现象、在挑选的葡萄清酵母中普通的多倍体的或幸整倍体的菌株。(Bakalinsky andSno, 1990:Hennequin et al.,2001:Bradbury et al.,2005): 从对生物直接课而得的结果证明了此法的简单与活力，此外，给体黑提取设旁路的可能逐步缩短了 如工时间和琼脂糖的使用，这有盒于安全和费用。在解母生态学的研究中，有能力用统计学果随单一S cerevisiae菌株的生长，合理的逼近是基本的。快速地、，廉价地、可靠地完成数以百计的遗传分析是明显 的优劳。 在我们的研究中，我门观察了2个菌株在2种温度和发醇的接种。2个温度下的表现确认了参数的影响 和5.cerevisiael国株的交直作用。据生产者称，南株此菌株3更嗜寒，因为它在15·C十分受控，而且 更适应低温发酵。在0◆C下，2个茵株在发酵的第1阶段表一致，然而在此情形下，菌株5证明了它较 好的竞争力一一在发醇的最后阶段清精浓度增如时它占据了主导地位。这个对有限度的有毒分子的变异是 发酵停滑的1个主要原因，闪时也解释了2个菌株在发酵中后期的比例。 总之，不用诸如苯酚的危险试剂或昂贵试剂如荧充标记涂料和特殊的嗜热水生国案合酶如上用琼脂糖 电冰，使此法适于实际生产。菌体生长1次只要4小时就可获得带的外形。此外，用于单独芮株的直接C果 时间应该进一步减少3小时，一个人可以用96孔板处理数以百计的样本。 此法可以应用于确保质量的峰母工业以发现野生酵母污染物并控制接种体的纯度。在葡萄清生产中， 发醇物和代谢物的交互作用对于敏感特性的表达是基木的，尽管此法是文化依赖的，因此它不是快速的“实 时”监控。检验南株优势或桃选南株比例的能力，会对在最优化酵母接种和评估菌株在葡面清配造中的够 觉效果为每一种发解选择合适的菌株有相助。一个文化依赖的多元C微卫星的应用，呵以避免菌种停蒂 并能快速控制培养，以健葡萄酒生产者在发酵过程中快连的调节。 鸣谢 我们感谢来自C-Istituto Sperimentale Lattiero Caseario的Lia Rossetti和Giorgio Giraffa 以及Lodi Italy的利川Bionunerics软件进行群分析的帮助
最近，利用 17 多形态标记对以上 2 种菌株的遗传分析显示，它们仅在第 4 位点有轻微的不同（包括 SC8132X）。SC8132X 位点表明，在这个研究中，DSM Fermivin 的 1 个等位基因和 Laffort Zymaflore ST 的 2 个等位基因在 47bp 被识别。这个重要的区别应该被琼脂糖和聚丙烯酰胺预制的凝胶体二者之一区别。 然而，我们的分析，表明 2 种菌株总体上在扩增子的数量及大小 SC8132X 扩增中区别很小。这个争论可能 因为在许多不同酵母生产过程中的变异而引起的一个小的遗传差异。令 1 个假设是酵母生产者在不同的市 场上用了同 1 个商业名称出售 2 种酵母菌株。 有趣的是，一些菌株给出了很多强烈的带。当每个位点的带的数目多于1个时，这可能是因为倍数染 色体位点杂合现象、在挑选的葡萄酒酵母中普通的多倍体的或非整倍体的菌株。(Bakalinsky andSnow, 1990; Hennequin et al., 2001; Bradbury et al., 2005); 从对生物直接 PCR 而得的结果证明了此法的简单与活力，此外，给 DNA 提取设旁路的可能逐步缩短了 加工时间和琼脂糖的使用，这有益于安全和费用。在酵母生态学的研究中，有能力用统计学跟随单一 S. cerevisiae 菌株的生长，合理的逼近是基本的。快速地、廉价地、可靠地完成数以百计的遗传分析是明显 的优势。 在我们的研究中，我们观察了2个菌株在2种温度和发酵的接种。2个温度下的表现确认了参数的影响 和S. cerevisiae菌株的交互作用。据生产者称，菌株5比菌株3更嗜寒，因为它在15 °C十分受控，而且 更适应低温发酵。在20 °C下，2个菌株在发酵的第1阶段表现一致，然而在此情形下，菌株5证明了它较 好的竞争力——在发酵的最后阶段酒精浓度增加时它占据了主导地位。这个对有限度的有毒分子的变异是 发酵停滞的1个主要原因，同时也解释了2个菌株在发酵中后期的比例。 总之，不用诸如苯酚的危险试剂或昂贵试剂如荧光标记涂料和特殊的嗜热水生菌聚合酶加上用琼脂糖 电泳，使此法适于实际生产。菌体生长1次只要4小时就可获得带的外形。此外，用于单独菌株的直接PCR， 时间应该进一步减少3小时，一个人可以用96孔板处理数以百计的样本。 此法可以应用于确保质量的酵母工业以发现野生酵母污染物并控制接种体的纯度。在葡萄酒生产中， 发酵物和代谢物的交互作用对于敏感特性的表达是基本的。尽管此法是文化依赖的，因此它不是快速的“实 时”监控。检验菌株优势或挑选菌株比例的能力，会对在最优化酵母接种和评估菌株在葡萄酒酿造中的感 觉效果为每一种发酵选择合适的菌株有帮助。一个文化依赖的多元PCR微卫星的应用，可以避免菌种停滞 并能快速控制培养，以便葡萄酒生产者在发酵过程中快速的调节。 鸣谢 我们感谢来自CRA-Istituto Sperimentale Lattiero Caseario 的Lia Rossetti 和 Giorgio Giraffa 以及Lodi Italy的利用Bionumerics软件进行群分析的帮助