在牛努中培养调士乳杆蘭发醉福合酸和生产多糖 关健词：乳杆菌，牛奶发酵，多糖 潮要：瑞士乳杆茵在牛奶中生长用值控制在62与培养物没有由值控制（■=0,5 “”,380眼多糖L',210山乳酸)相比有一个缓慢增长的速度（射=0.27h)生产 较少的胞外多糖(4gLˉ“)，但乳酸产量增加(4药W》。两种不同的培养条件都表现出 混合酸发酵生成醋酸。这一发解过程不仅关系到柠檬酸代谢，面且还与丙酮酸途径有关。 引直 瑞士乳杆商，一种专属同型发醇乳酸商(LB),在乳制品加工行业作为发酵剂培养物 在制造酸奶，硬奶醇和意大利干奶修发面发挥了重要作用。胞外多糖(5)产生菌合并作 为发醇剂菌种将避免使用在大多数微盟国家不允许的植物或动物米源的添加剂（吉布森和罗 的1995年)，其带米提高了流变性能的新产品的开发，。 在牛奶中用柠檬酸代谢生产留酸和/或双乙酰与许多发酵乳制品风味的研发同样重要。 但是很少有报告涉及哈热乳酸杆菌柠檬酸代谢《希基等，1983年)， 本文讨论了瑞士乳酸商在牛奶中用自然条作发酵和控制发醇两种方式生产胞外多糖 及发酵根式 树料与方法 微生物的生长条件 瑞士乳杆菌ATC15807接种在夹菌(115℃，20分钟)的10%(w/v)的再生酸脂乳， 在工作容2000毫升的发醇罐中，37℃，培养60小时.在无通风条件下，自然和控制pH (用无南的1o1H0H调整H至6.2)两种方式同时分数发酵培养。温度(37℃)，授拌速率 (转速100aim)和plH值自动化挖制， 发酵过程允许进行帅：样品在不同的封间阿隔从发酵容器中核无菌地国收。并立即做 在冰上冷却以确定胞外多糖的收益率，细胞活力，最锋产物，柠檬酸消托量，剩余的乳糖 和其水解产物（葡萄糖和半乳糖）。特定生长率(#)是通过计算一个率对数图像c.工.a.山 一时间的斜率得到，细图活性测定是通过适当地稀释后在RS琅脂平板中培养后测定(D0Man eta,160年)。平板上南落经37℃，48培养逐渐形成，结果表示L,山.·
在牛奶中培养瑞士乳杆菌发酵混合酸和生产多糖 关键词：乳杆菌，牛奶发酵，多糖 摘要：瑞士乳杆菌在牛奶中生长 pH 值控制在 6.2 与培养物没有 pH 值控制（μ = 0.5 h - 1， 380 mg 多糖 L - 1，210 mM 乳酸）相比有一个缓慢增长的速度（μ = 0.27 h - 1）生产 较少的胞外多糖（49mg L - 1） ，但乳酸产量增加（425 mM）。两种不同的培养条件都表现出 混合酸发酵生成醋酸，这一发酵过程不仅关系到柠檬酸代谢，而且还与丙酮酸途径有关。 引言 瑞士乳杆菌，一种专属同型发酵乳酸菌（LAB） ，在乳制品加工行业作为发酵剂培养物 在制造酸奶，硬奶酪和意大利干奶酪发面发挥了重要作用。胞外多糖（EPS）产生菌合并作 为发酵剂菌种将避免使用在大多数欧盟国家不允许的植物或动物来源的添加剂（吉布森和罗 伯1995年），其带来提高了流变性能的新产品的开发，。 在牛奶中用柠檬酸代谢生产醋酸和/或双乙酰与许多发酵乳制品风味的研发同样重要。 但是很少有报告涉及嗜热乳酸杆菌柠檬酸代谢（希基等，1983 年）。 本文讨论了瑞士乳酸菌在牛奶中用自然条件发酵和 pH 控制发酵两种方式生产胞外多糖 及发酵模式。 材料与方法 微生物的生长条件 瑞士乳杆菌ATCC 15807接种在灭菌（115℃，20分钟）的10 ％（w/ v）的再生脱脂乳， 在工作容积2000毫升的发酵罐中，37℃，培养60小时。在无通风条件下，自然pH和控制pH （用无菌的1mol NH4OH调整pH至 6.2）两种方式同时分批发酵培养。温度(37℃)，搅拌速率 （转速 100min−1）和pH值自动化控制。 发酵过程允许进行60h; 样品在不同的时间间隔从发酵容器中被无菌地回收，并立即放 在冰上冷却以确定胞外多糖的收益率，细胞活力， 最终产物，柠檬酸消耗量，剩余的乳糖 和其水解产物（葡萄糖和半乳糖）。特定生长率（μmax）是通过计算一个半对数图像c.f.u.mL-1 —时间的斜率得到。细胞活性测定是通过适当地稀释后在MRS琼脂平板中培养后测定（De Man et al.1960年）。平板上菌落经37℃，48 h培养逐渐形成，结果表示为c.f.u.mL- 1
b句 360 至 24 24 Time (h) Time(h) 图1由瑞士乳杆菌在牛奶分批培养的细胞存活率（一●一）和PS的产量(-O):《a) 值6.2，(b)自然值. 脑外多糖的量化和单体分析 从分离的S中取出100毫升用E型XY链需蛋白酶《。)水解牛奶蛋白质所得的样品。 PS通过离心分离，用乙醇沉淀(zz1等.1996年)，在2L蒸馏水中冷冻干绳，并用瑰 脂糖凝胶桂B(a)测定其分子质量（师）。用0,05Tris/C1缓冲液(H7)洗税抽提 得到S,并用混合的葡聚糖（▣）以每个0.25g■校准凝胶柱（分子量39100：73 000:515000和2000000)。绘制葡聚糖的相对分子质量的对数一洗脱体积的图像雨定E四 的相对分子质量。经纯化和水解《3测三氯乙酿，在1O0℃处理6小时)5后得到的单糖组成 是用高效液相色滞法测定，用有机酸色谱柱（坠enonene©r)在55℃以水为流动相，速度 0,8ln。计算相对比例的峰面积以估计单体组成。总S量（表示为'的）以葡萄 糖作为标准使用苯酚硫酸法(ubois等人.1956年)售计。 其他测定 残留的乳糖，葡萄糖和半乳糖以及乳酸和醒酸分别用如上所描述的高效液相色谐法测定： 柠檬酸测定使用酶学方法(Boehr inger:mnheim GabH,Gernan时)。在高效液相色情分析 前，样品用Carrex方法(Boehringer)净化·结果用M表示。 重复性 本文提出的所有结果是三个实验的平均植。结果之同的差异小于10%。 结果和讨论 瑞士乳酸杆南ATC15807在牛奶中分批培养的生长动力学和乳酸及5产量由与 非粒制的培养是完全不月的《图1-3》·在值为6.2（图1a),培养物显示出一个低的
图1 由瑞士乳杆菌在牛奶分批培养的细胞存活率(–●–)和EPS的产量(-○-); （a）pH 值6.2 ，（b）自然pH值。 胞外多糖的量化和单体分析 从分离的EPS中取出 100 毫升用E型XIV链霉蛋白酶（σ）水解牛奶蛋白质所得的样品。 EPS通过离心分离，用乙醇沉淀（ Mozzi等.1996年），在2 mL 蒸馏水中冷冻干燥，并用琼 脂糖凝胶柱4B （σ）测定其分子质量（MW）。用0.05M Tris/HCl缓冲液（pH 7）洗脱抽提 得到 EPS ，并用混合的葡聚糖（σ）以每个 0.25 mg ml−1校准凝胶柱(分子量 39 100; 73 000;515 000 和 2 000 000)。绘制葡聚糖的相对分子质量的对数—洗脱体积的图像确定EPS 的相对分子质量。经纯化和水解（3M三氟乙酸，在100℃处理6小时）EPS后得到的单糖组成 是用高效液相色谱法测定，用有机酸色谱柱（ Phenomenex ）在55℃以水为流动相， 速度 0.6 ml min−1 。计算相对比例的峰面积以估计单体组成。总EPS量（表示为mgL- 1的）以葡萄 糖作为标准使用苯酚硫酸法（Dubois等人.1956年）估计。 其他测定 残留的乳糖，葡萄糖和半乳糖以及乳酸和醋酸分别用如上所描述的高效液相色谱法测定; 柠檬酸测定使用酶学方法（Boehringer Mannheim GmbH, Germany）。在高效液相色谱分析 前，样品用Carrez方法（Boehringer）净化 。结果用mM表示。 重复性 本文提出的所有结果是三个实验的平均值。结果之间的差异小于10％ 。 结果和讨论 瑞士乳酸杆菌ATCC 15807在牛奶中分批培养的生长动力学和乳酸及EPS 产量由与 非pH控制的培养是完全不同的（图1-3）。在pH值为6.2（图 1a ），培养物显示出一个低的
特定生长率（μ■0.27h),细胞活力(3×10个细胞集落a)和EP5的形成物(49/ L),但高乳酸产量(25)《图2：)：这一事实表明，糖代谢主要是用于合成乳酿而 不是5。在圆6.时在培养基中积累的乳酸，对于尽快开始稳定期和低细胞存活率似乎是 关键因子（图1）。相比之下，培养在非H值控制的条件下以更高的增长率生长(：=0.5 h)，生产83%以上的P5(30感/L)(图1b),但少于4相%的乳酸(210M)(图 2h). 分离的是高分子聚合物(&2×10心至2×10心)，其中含有大量的磷酸盐（平 均水平81第》，葡萄糖和乳糖比例为1：1(6,2)和2：1（自然H),和微量的鼠李糖 (总糖含量的6.1%》。在它们的化学组成中巨5没有差异。尽管如此，在值62培养物是不 成粘丝的可能是由于乳酸的产量和/或水解降的存在(C©rn1g等.I988年)， 在自然H值条件培养，发酵24小时后乳糖浓度几乎是零，版，2，大约剩余0W糖（图 3a和3路)·瑞士乳杆南T0C15807释成葡萄糖和率乳糖到生长的牛奶中，微生物生长状况 债载于培养时间和培养条件。 在州植方6,2（图3：），微生物完全地清耗两种处于较高浓度(42-6M)的糖，在自 然pH值条件下培养发酵60h后（图）。乳糖桔喝后稳步彩成乳酸的值（图2）可能与 葡萄糖和半乳糖的消托有关。 瑞士乳杆菌ATC15807在自然圆和控制H的条件下发酵显示混合酸发酵与作为最终产 品的乳酸(210245W)和醋酸。这是与在指数障段的柠檬酸代谢有关（最多12小时）（图 2a和2西)。在无控制的条件下培养柠檬酸目前在牛奶中几乎完全代谢，当值为6.2时大 约剩禽4.6M,在发酵60角后，酵酸总量在自然条件(134W),控制值(16.5M),清 楚地表明这是通过替代途径从丙制酸合成。 以下是理解，柠檬酸由柠檬酸酶裂解生产醋酸（不含三磷酸酸苷的形成）和等分子浓度 的草酰乙酸盐。该草酰乙酸照去羧基变成丙酮酸，这反过来将被分成醋酸通过丙酮酸殿氧 酶和酚酸激酶途径-导致三磷酸腺甘的产生0art)-Teysset等.196年，Garrigues等.197 年)，该脱骏基的草酰乙酸在酸性环境中将发挥作用。根据t©agm1等。(1999年)，吸 收的柠檬酸，糯合糖酵解中产生乳酸的流出过程，是一种调节机制维护叶值平衡，通过草 酰乙酸脱羧消耗质子。此外，产生的解酸是比乳酸更抗菌的化合物。可以帮助同型发酵的乳 酸细百在自然环境和设计条件下与其他耐酸微生物相比更有竞争力
特定生长率（μ = 0.27 h- 1），细胞活力（3 × 108个细胞集落ml-1）和EPS的形成物（49mg/ L） ，但高乳酸产量（425 mM） （图2a ）;这一事实表明，糖代谢主要是用于合成乳酸而 不是EPS。在pH 6.2时在培养基中积累的乳酸，对于尽快开始稳定期和低细胞存活率似乎是 关键因子（图1a ）。相比之下，培养在非pH值控制的条件下以更高的增长率生长（μ = 0.5 h - 1） ，生产83 ％以上的EPS（360 mg/L）（图1b） ，但少于49 ％的乳酸（210mM）（图 2b）。 分离的EPS是高分子聚合物（ 8.2 × 105 至2 × 106 ） ，其中含有大量的磷酸盐（平 均水平81%），葡萄糖和乳糖比例为1:1 （ pH6.2 ）和2:1 （自然pH） ，和微量的鼠李糖 （总糖含量的6.1%）。在它们的化学组成中EPS没有差异。尽管如此，在pH值6.2培养物是不 成粘丝的可能是由于乳酸的产量和/或水解酶的存在（ Cerning等. 1988年）。 在自然pH值条件培养，发酵24小时后乳糖浓度几乎是零，pH6.2，大约剩余40mM糖（图 3a和3b ）。瑞士乳杆菌ATCC 15807释放葡萄糖和半乳糖到生长的牛奶中，微生物生长状况 依赖于培养时间和培养条件。 在pH值为6.2（图3a ），微生物完全地消耗两种处于较高浓度（42-46mM）的糖，在自 然pH值条件下培养发酵60 h后（图2b）。乳糖枯竭后稳步形成乳酸的pH值（图 2b）可能与 葡萄糖和半乳糖的消耗有关。 瑞士乳杆菌ATCC 15807在自然pH和控制pH的条件下发酵显示混合酸发酵与作为最终产 品的乳酸（210-245mM）和醋酸，这是与在指数阶段的柠檬酸代谢有关（最多12小时） （图 2a和2b ）。在无pH控制的条件下培养柠檬酸目前在牛奶中几乎完全代谢，当pH值为6.2时大 约剩余4.6mM。在发酵60h后，醋酸总量在自然条件（13.4mM） ，控制pH值（ 16.5mM），清 楚地表明这是通过替代途径从丙酮酸合成。 以下是理解，柠檬酸由柠檬酸酶裂解生产醋酸（不含三磷酸腺苷的形成）和等分子浓度 的草酰乙酸盐。该草酰乙酸脱去羧基变成丙酮酸，这反过来将被分成醋酸-通过丙酮酸脱氢 酶和醋酸激酶途径-导致三磷酸腺苷的产生(Marty-Teysset 等.1996年，Garrigues等. 1997 年）。该脱羧基的草酰乙酸在酸性环境中将发挥作用。根据 toMagni 等。（1999 年），吸 收的柠檬酸，耦合糖酵解中产生乳酸的流出过程，是一种调节机制维护 pH 值平衡，通过草 酰乙酸脱羧消耗质子。此外，产生的醋酸是比乳酸更抗菌的化合物，可以帮助同型发酵的乳 酸细菌在自然环境和设计条件下与其他耐酸微生物相比更有竞争力
420 Acetic 20 120 2431 Time (h) Time (h) 图2瑞士乳杆菌在牛奶中分批培养所得的乳酸产量(-■-)和量酸(-口-)： a》&2,b)自然 o 的 Citric 4 24 Time (h) Time间 图3.瑞士乳杆菌在牛奶中分批培养剩余的乳糖(-▲一)，半乳糖(-△一)，葡司糖 (-■-），和柠檬酸(-口-）： (a》H&2,b)自然
图 2 瑞士乳杆菌在牛奶中分批培养所得的乳酸产量(–■–)和醋酸(–□–); (a) pH 6.2, (b) 自然 pH. 图3. 瑞士乳杆菌在牛奶中分批培养剩余的乳糖 (–▲–), 半乳糖(–△–), 葡萄糖 (–■–), 和柠檬酸(–□–); (a)pH 6.2, (b) 自然 pH