南开大学 案例 季也蒙假丝酵母在单一和混合培养基中木糖醇生产的发酵性能_微生物发酵工程

南开大学微生物发醇工程室例教学 季也蒙假丝醇母在单一和视合培养基中木糖醇生产的发醇性能 Solange I.Mussatto Carla J.5.M Silva Ines C.Roberto (张帅短译) 摘要：用半合成培养基发酵颅拟半纤维素水解产物中的糖类化合物（约85g/L木糖，17。L糖，9/儿 树胶醛糖)以此深究评估葡萄糖和树胶醛糖季也蒙假丝醇母在木糖木糖醇转化中的影响。结果显示，葡萄 糖阵低了木糖消耗的八。树胶征糖不影响木糖消耗但酵母利用木糖受葡萄糖和树胶醛糖的完全抽制。树 胶征糖只有被用作单一碳源是才被利用。当发醇培养基中设有葡萄糖时木糖醇产量最高。另一方面，树欧 醛糖更适于生产木糖醇（能达到0.7gg的木糖消耗）并且它不影响体积测定的产率(QP085g),式 获得的价植与单独用木糖的接近。 前言：木糖醇是一种天然五碳糖醇，由于它的甜味（与莲糖一样高）使其在食品和制药领城产生了极 高的价值，普垢应用与降低口腔清璃和作为非聘岛素类糖类物质用于鞠岛素依赖性糖尿病患者。另外， lussatto and Robertoi还证明木糖醇还对急性耳炎，骨质疏松和韩部感染其预防作用。(2002) 工业上，利用半纤雄素水解产物中的木糖（源于木聚糖）的催化还源反应生产(Laja,em 197),由于其分离纯化，以及从率纤维素分离掉次要水解产物存在较大困难，并且产量只有基于术聚糖 生产的5八一6%，用这种程序生产木糖醇成本根高。另外，木聚糖还可以运用生物技术通过微生物（主要 是醇碍苗)对水解产物进行发酵获得。这种途径相比于化学方法根有经济效益，因为木糖一木糖醇转化是 一个选择性的的过程（木糖溶液不需要净化），能获得较高的产量(inkel.hausen,Kuznanova I9g8)。 一生菌株敲考黎用商用木糖成糖溶液转化成木糖醇。其中，经过精心挑选认定假丝酵母属（特别是 Candic由uiLLiermoedii,Candida p随rapsiLosis.Candida tropicaLis,和Candida boidini)是木糖 醇最好的生产者。这些酵母能生产木糖醇可能是因为它们含有木糖还原酶(C1,1,1.21),以NA州为辅因 子，它霍化木糖转化成木糖醇作为木糖代谢的第一步限制着产量，（得ink©Chausen,和z国n0wa1998)。 尽管如此，醉母产木解醇的产量很多因素包括南株，培养基中初始细散凝聚程度和培养条件如温度、、 初始底物浓度、氧气、其他糖类以及它门的比率和钟制物等(Pj泊等1998)。所以，了解这些影响因 素在发展利用大规核生物技术发醇大量生产木糖醇中是最基本的， 其它糖类物质（主要是葡萄糖）的出现。是影响发酵的一个重要利题(Le1992)。当一些更容易被 利用的糖出现时，正常情况下有效生产木糖醇的菌株就银少利用戊糖了，根据Lth肥r等(2001)的研究， 单糖的比率可能影响传送咸者酶的动力学特性以至于不同的糖争夺传运载体或者同时代谢。然而，不月酵 母对其它糖类作出调整的敏感性不用。 现在的工作评价了葡葡糖和树胶征糖在白假丝酵母木糖一木糖醇发酵性能的影响。实验构造出一种半 1

南开大学微生物发酵工程案例教学 1 季也蒙假丝酵母在单一和混合培养基中木糖醇生产的发酵性能 Solange I. Mussatto . Carla J. S. M. Silva .Inês C. Roberto （张帅翻译） 摘要：用半合成培养基发酵模拟半纤维素水解产物中的糖类化合物(约85 g/ L 木糖, 17 g/L糖， 9g/L 树胶醛糖)以此探究评估葡萄糖和树胶醛糖季也蒙假丝酵母在木糖-木糖醇转化中的影响。结果显示，葡萄 糖降低了木糖消耗的30%。树胶醛糖不影响木糖消耗但酵母利用木糖受葡萄糖和树胶醛糖的完全抑制。树 胶醛糖只有被用作单一碳源是才被利用。当发酵培养基中没有葡萄糖时木糖醇产量最高。另一方面，树胶 醛糖更适于生产木糖醇（能达到0.74gg-1的木糖消耗）并且它不影响体积测定的产率(QP=0.85 g g-1 )，其 获得的价值与单独用木糖的接近。 前言：木糖醇是一种天然五碳糖醇，由于它的甜味（与蔗糖一样高）使其在食品和制药领域产生了极 高的价值，普遍应用与降低口腔溃疡和作为非胰岛素类糖类物质用于胰岛素依赖性糖尿病患者。另外， Mussatto and Roberto还证明木糖醇还对急性耳炎，骨质疏松和肺部感染其预防作用。（2002） 工业上，利用半纤维素水解产物中的木糖（源于木聚糖）的催化还原反应生产（MeLaja ，HamäLäinen 1977）。由于其分离纯化，以及从半纤维素分离掉次要水解产物存在较大困难，并且产量只有基于木聚糖 生产的50%--60%，用这种程序生产木糖醇成本很高。另外，木聚糖还可以运用生物技术通过微生物（主要 是酵母菌）对水解产物进行发酵获得。这种途径相比于化学方法很有经济效益，因为木糖—木糖醇转化是 一个选择性的的过程（木糖溶液不需要净化），能获得较高的产量（WinkeLhausen ，Kuzmanova 1998）。 一些菌株被考察用商用木糖或糖溶液转化成木糖醇。其中，经过精心挑选认定假丝酵母属（特别是 Candida guiLLiermondii, Candida parapsiLosis, Candida tropicaLis,和 Candida boidini）是木糖 醇最好的生产者。这些酵母能生产木糖醇可能是因为它们含有木糖还原酶(EC 1.1.1.21)，以NADPH为辅因 子，它催化木糖转化成木糖醇作为木糖代谢的第一步限制着产量。（WinkeLhausen ，Kuzmanova 1998）。 尽管如此，酵母产木糖醇的产量很多因素包括菌株，培养基中初始细胞凝聚程度和培养条件如温度、pH、 初始底物浓度、氧气、其他糖类以及它们的比率和抑制物等（Parajó 等 1998）。所以，了解这些影响因 素在发展利用大规模生物技术发酵大量生产木糖醇中是最基本的。 其它糖类物质（主要是葡萄糖）的出现，是影响发酵的一个重要问题（Lee 1992）。当一些更容易被 利用的糖出现时，正常情况下有效生产木糖醇的菌株就很少利用戊糖了。根据WaLther 等 (2001)的研究, 单糖的比率可能影响传送或者酶的动力学特性以至于不同的糖争夺传送载体或者同时代谢。然而，不同酵 母对其它糖类作出调整的敏感性不同。 现在的工作评价了葡萄糖和树胶醛糖在白假丝酵母木糖--木糖醇发酵性能的影响。实验构造出一种半

南开大学满生物发醇工程老创教学 合成培养基，其中木糖作为主要的糖类，加入成不加入萄萄糖和树胶醛糖作为辅底物。木糖，葡萄糖和树 胶醛糖的比为10：2：1，这也是通常情况下农业残渣中半纤维素水解产物的比例。文章对不含木糖的培养 基发卧性能也做了分析和讨论。 (朝玉郴泽) 1材料和方法 11微生物菌体的培养与按种 季也蒙假纶酵母T120037保存在°C的麦芽糖球雷斜面上，接种时接一满环的菌体到125的烧瓶中 由20g1木糖。3.0g1.4,)2S0,0.1gLCa☐。.2H0,20%(r/)米糠汁组成的培养基上在30°C, 200桃/分条作下培养24小时，然后离心(1,100×保20分)获得茵体，用蒸馏水洗涤后直接接种到发酵培 养基上，米模计由米雕是浮液在121·C灭南20分钟，冷却至室温，再离心(1,100×g)20分钟，去上清4 度下保存至少1天。 1,2培养基和发醇条件 培养基的配方：木糖(5gL),葡萄糖(17落L,树胶醛糖(9gL)表1果已经给出。每种糖溶 液都在112度下灭菌15分钟，所有培养基都添如用于接种培养的营养液，并调节h至6.5且如入】.0-20 L原始细胞。发酵用125L烧凰装501培养基在摇味上200转/分30°C进行96小时，发酵过程通过周期取 样进行监控，以测定菌体细胞的生长。木糖、葡面糖、树胶醛糖的消耗。以及木糖醇的生成。 13分析方法 木糖、葡萄糖、树胶醛糖和木糖醇的浓度用高精度的液体版多孔性阴离子交换树脂桂HX一87H (300×7.8m)和折射率测定.样品上柱条件：柱温5度Q01N硫磺酸作流动相。流速06nL/ain,上样 体积20L。商体浓度用紫外分光光度法测量细鞋在不同培养基上(200T30°C for T2h)生长得到 的光密度(600m)一菌体干重曲线估计出。样品稀释到每单位读数为0.05~0.500.， 2

南开大学微生物发酵工程案例教学 2 合成培养基，其中木糖作为主要的糖类，加入或不加入葡萄糖和树胶醛糖作为辅底物。木糖、葡萄糖和树 胶醛糖的比为10：2：1，这也是通常情况下农业残渣中半纤维素水解产物的比例。文章对不含木糖的培养 基发酵性能也做了分析和讨论。 （胡玉彬翻译） 1 材料和方法 1.1 微生物菌体的培养与接种 季也蒙假丝酵母FTI20037保存在4°C 的麦芽糖琼脂斜面上，接种时接一满环的菌体到125mL的烧瓶中 由20 g L -1 木糖, 3.0 g L -1 (NH4)2SO4, 0.1 g L -1 CaCL2.2H2O, 20% (v/v) 米糠汁组成的培养基上在30°C， 200转/分条件下培养24小时，然后离心(1,100×g, 20 分)获得菌体，用蒸馏水洗涤后直接接种到发酵培 养基上，米糠汁由米糠悬浮液在121°C灭菌20分钟，冷却至室温，再离心（1,100×g ）20分钟，去上清4 度下保存至少1天。 1.2 培养基和发酵条件 培养基的配方：木糖(85 g L -1 ), 葡萄糖 (17 g L -1 ), 树胶醛糖 (9 g L -1 )表1里已经给出，每种糖溶 液都在112度下灭菌15分钟，所有培养基都添加用于接种培养的营养液，并调节ph至6.5且加入1.0–2.0 g L -1原始细胞，发酵用125mL烧瓶装50mL培养基在摇床上200 转/分 30°C进行96小时，发酵过程通过周期取 样进行监控，以测定菌体细胞的生长，木糖、葡萄糖、树胶醛糖的消耗，以及木糖醇的生成。 1.3 分析方法 木糖、葡萄糖、树胶醛糖和木糖醇的浓度用高精度的液体版多孔性阴离子交换树脂柱HPX-87H (300×7.8 mm)和折射率测定。样品上柱条件：柱温45度 0.01N 硫磺酸作流动相，流速0.6nL/min，上样 体积20uL。 菌体浓度用紫外分光光度法测量细胞在不同培养基上（200 rpm 30°C for 72 h）生长得到 的光密度（600nm）--菌体干重曲线估计出。样品稀释到每单位读数为0.05～0.5OD

南开大学微生物发醇工程室例教学 发酵培养基 发酵参数 (碳源) P Tine 的维培与绿户5gP综子与g I fbsorr 身足 20 o 66线 10.74 02 导第 120 鱼5 每1 1413 2 10 013 40 017 年的 5140 4 5X+0 难足 g 14 07 411 4161 香X+A 料 衫 生绣 114 6M8 镜河 2 7GA 9 86d 0 参过 151 053 e时 鱼79 0.05 1 1能 X:不新，G满香斯，A:树胶保精 表1不同半合成培养基中不月糖类混合物对发酵的影响 1.4发醇参数的计算 木糖醇9。(gLh)和单位体积细胞的生产力0.(g1)、单位体积木糖的消耗速度Q.(gLh)用 木糖醇浓度P(gL和总细胞数x(gL)的比或者木糖消耗和每次最终发酵总时间()的比计算·木糖 醇产出系数Y,为每次发酵木糖的消耗比率，菌体细胞的产出系数T为构成细型的木糖和葡萄糖与总培养 基中每次消耗的糖的比，木糖醇单位饵胞产量为P和X的比，木糖-木糖醇的转化率计算为Y和阳sa等 (1988的建议参数下的理论值(0,917gg)的比，木糖醇单位生产率为0和的比。 2.试验结果 2,1葡萄糖和树胶盛精对季也蒙假丝酵母木糖消耗量的影响 三种发解培养基由木韧组成，并包含葡萄糖和树胶醛糖中的一种或者两种（培养林5、6、8），其组 成都是清楚的，并用于季也蒙假丝醇母的发酵培养。这些培养基中，经过6小时的发醇，葡萄糖就被消耗 殆尽，其消耗速率28gLh)比木糖0.79gL一h)消耗速率要快的多。实际上，图1可以看出。在有 葡萄糖存在的培养基5、8中，木糖的消耗速率也比没有葡萄糖的培养基2、6要慢。从表1的%值中可以看 出培养基5、8中木糖的消耗比培养基2、6要慢30%，另外，由干葡萄糖被单独当作碳源（培养基3）和混 合木糖作碳潭（培养基马）时，清耗速率都是几乎相同的，所以可以认为在木糖的存在并不影响季也蒙假 纶酵母对葡图糖的利用。 (曹葛额保) 树胶征糖只有核单独作为碳源时才拔季也蒙假丝醇母所利用。合有木糖、葡萄糖中一种成两种的培养 基中微生物是不消耗树胶醛糖的。尽管在存在糖混合物的培养基中不消耗，但树胶径糖的存在并不妨哥培 养基中木糖成萄萄糖清柜，表1可以看出，培养基2（纯木糖）和6（木糖和树胶醛糖）中与培养基5（木糖 和葡萄糖)和8（木糖、葡萄糖和树胶径糖）中木糖的消耗是相近的， 3

南开大学微生物发酵工程案例教学 3 表 1 不同半合成培养基中不同糖类混合物对发酵的影响 1.4 发酵参数的计算 木糖醇Qp (g L-1 h -1 )和单位体积细胞的生产力Qx (g L-1 h -1 )、单位体积木糖的消耗速度Qs (g L-1 h -1 )用 木糖醇浓度P( g L-1 )和总细胞数X( g L-1 )的比或者木糖消耗和每次最终发酵总时间（h）的比计算 。木糖 醇产出系数Yp/s为每次发酵木糖的消耗比率，菌体细胞的产出系数Yx/s为构成细胞的木糖和葡萄糖与总培养 基中每次消耗的糖的比，木糖醇单位细胞产量为P和X的比，木糖-木糖醇的转化率计算为YP/S 和Barbosa 等 (1988)的建议参数下的理论值(0.917 g g-1 )的比，木糖醇单位生产率为QP 和X的比。 2.试验结果 2.1 葡萄糖和树胶醛糖对季也蒙假丝酵母木糖消耗量的影响 三种发酵培养基由木糖组成，并包含葡萄糖和树胶醛糖中的一种或者两种（培养基5、6、8），其组 成都是清楚的，并用于季也蒙假丝酵母的发酵培养。这些培养基中，经过6小时的发酵，葡萄糖就被消耗 殆尽，其消耗速率(2.8 g L −1 h −1 )比木糖(0.79 g L −1 h −1 )消耗速率要快的多。实际上，图1可以看出，在有 葡萄糖存在的培养基5、8中，木糖的消耗速率也比没有葡萄糖的培养基2、6要慢。从表1的Qs值中可以看 出培养基5、8中木糖的消耗比培养基2、6要慢30%， 另外，由于葡萄糖被单独当作碳源（培养基3）和混 合木糖作碳源（培养基5）时，消耗速率都是几乎相同的，所以可以认为在木糖的存在并不影响季也蒙假 丝酵母对葡萄糖的利用。 （曹磊翻译） 树胶醛糖只有被单独作为碳源时才被季也蒙假丝酵母所利用，含有木糖、葡萄糖中一种或两种的培养 基中微生物是不消耗树胶醛糖的。尽管在存在糖混合物的培养基中不消耗，但树胶醛糖的存在并不妨碍培 养基中木糖或葡萄糖消耗，表1可以看出，培养基2（纯木糖）和6（木糖和树胶醛糖）中与培养基5（木糖 和葡萄糖）和8（木糖、葡萄糖和树胶醛糖）中木糖的消耗是相近的

南开大学微生物发醇工程室例教学 Etmnerteion midis 75 ■=20X0 0-50X+G句 △-80X车A) 一0仪+G+A) 45 15 46 60 7 105 Fermentation time (h) 图1.各种培养基中木糖的利用 2.2葡萄糖和树胶感糖对季也蒙假丝酵年产木轴醇的影响 在单一糖培养基上，木糖和树胶径糖可以核生产成木糖醇，而葡萄糖只川于饵胞生长，而不产生木糖 醇。其中，木糖产木糖醇的产率最高（表1）。所以，木糖被优先被选用于微生物生产木糖醇。 只有树胶醛糖被用作单一碳源时，季也蒙假控醇母才对其进行发醇。混合培养基阻止树胶臣糖的消耗。 所以，这些培养基中，木糖醇的产出完全米源干木糖。图2可以看出，尽管树胶醛糖没有消毛，它对发酵 过程中木糖醇的产出没有影响。这种情况不同于葡萄糖，它的存在对发酵产生木糖醇有影响。图2清楚的 显示出没有葡萄糖存在的培养基2和6的木糖醇产出明显比有葡萄糖存在的5和8快。没有葡萄糖存在的培养 基产率(72小时后约为60/L)较高，而有葡萄糖存在的培养基96小时后产率只达到49/L。 就限制因素而言，葡萄糖的存在时木糖醇产出系数(YN)下降了1作，同时也降低了发酵效事（可）。 树取醛糖存在时，大的上升了8篇，这显示它对季也蒙假统醇母木糖代谢起制微作用。基于这种积极作 用，在混合培养基8中树校能糖消除了葡萄糖的抑制作用，其Y(0.67g)与纯木糖培养基2达到的0.68gg 近拟， 0 Lermentition med a ■-2) 0-5度+G 0 一0一6X+A0 一8仪+G+A 30

南开大学微生物发酵工程案例教学 4 图1.各种培养基中木糖的利用 2.2 葡萄糖和树胶醛糖对季也蒙假丝酵母产木糖醇的影响 在单一糖培养基上，木糖和树胶醛糖可以被生产成木糖醇，而葡萄糖只用于细胞生长，而不产生木糖 醇。其中，木糖产木糖醇的产率最高（表 1）。所以，木糖被优先被选用于微生物生产木糖醇。 只有树胶醛糖被用作单一碳源时，季也蒙假丝酵母才对其进行发酵。混合培养基阻止树胶醛糖的消耗。 所以，这些培养基中，木糖醇的产出完全来源于木糖。图2可以看出，尽管树胶醛糖没有消耗，它对发酵 过程中木糖醇的产出没有影响。这种情况不同于葡萄糖，它的存在对发酵产生木糖醇有影响。图2清楚的 显示出没有葡萄糖存在的培养基2和6的木糖醇产出明显比有葡萄糖存在的5和8快。没有葡萄糖存在的培养 基产率（72小时后约为60g/L）较高，而有葡萄糖存在的培养基96小时后产率只达到49 g/L。 就限制因素而言，葡萄糖的存在时木糖醇产出系数（YP/S ）下降了10%，同时也降低了发酵效率（η）。 树胶醛糖存在时，YP/S 大约上升了8%，这显示它对季也蒙假丝酵母木糖代谢起刺激作用。基于这种积极作 用，在混合培养基8中树胶醛糖消除了葡萄糖的抑制作用，其YP/S（0.67gg-1）与纯木糖培养基2达到的0.68 gg-1 近似

南开大学微生物发醇工程案例教学 图2季也蒙假控酵母在含和不含葡葡糖和树胶征糖培养基中木糖醇的生产情况 表1也表明在发醇培养基中葡面糖对木糖醇体积计算产率的影响强于Y:实际上，含葡萄糖培养基 木糖醇体积计算产率与单位生产率④分别是0院50%，这低于无葡萄糖培养基。这些结果证实了葡萄糖比率 为1/B对季也蒙假往酵母产木糖丽的抑制作用。一些植如鸣和●不受培养基中树胶醛糖的影响。（见表1 中培养基2和6,5和8) 2.3葡萄糖和树胶蔽糖对季也蒙假丝酵母菌体数量的影响 与与其结果一样，季也蒙假往酵母在产木糖醇过程中产生的菌数因培养基中的碳源不同而各异。单一 培养基的培养（图3）显示葡萄糖是季也蒙假批酵母生长的最佳成物，因为它在6小时内就达到了最高商浓 和最高体积产率(=0，脱《Lh,表1)。木糖和树胶征糖显示了近似的0。但与葡萄糖相比都低大约 十倍。 一▲一Absent 垂一关y路称 一O一Amw 04006070 图3单一碳源率合成培养基细商产量 Fermentaton time (hi 除7（无木糖）以外的混合培养基都达到近似的0，T产生的0值比其它三种高十倍。在木糖培养基中 更低的0归因于其碳源。所以更少的度物按用作细腹生长。因此。存在葡面糖的培养基3和7达到最高的收。 并且没有木糖醇的生产。Y也显示含木糖培养基细胞增长低子不含木糖培养基。 很有趣的发现培养基1的菌体数量根少（营养中没有糖的加入）。事实上，与其它培养基相比，这组 培养基的菌体产量是无意义的。这表明(L》2S0,CC1.20和麦镶计只能算作一种营养，而非产能或细 5

南开大学微生物发酵工程案例教学 5 图 2 季也蒙假丝酵母在含和不含葡萄糖和树胶醛糖培养基中木糖醇的生产情况 表1也表明在发酵培养基中葡萄糖对木糖醇体积计算产率Qp的影响强于YP/S。实际上，含葡萄糖培养基 木糖醇体积计算产率与单位生产率qp分别是40%50%，这低于无葡萄糖培养基。这些结果证实了葡萄糖比率 为1/5对季也蒙假丝酵母产木糖醇的抑制作用。一些值如QP 和 qP不受培养基中树胶醛糖的影响。（见表1 中培养基2和6，5和8） 2.3 葡萄糖和树胶醛糖对季也蒙假丝酵母菌体数量的影响 与与其结果一样，季也蒙假丝酵母在产木糖醇过程中产生的菌数因培养基中的碳源不同而各异。单一 培养基的培养（图3）显示葡萄糖是季也蒙假丝酵母生长的最佳底物，因为它在6小时内就达到了最高菌浓 和最高体积产率（QX=0.62 g L −1 h −1 , 表 1）。木糖和树胶醛糖显示了近似的QX，但与葡萄糖相比都低大约 十倍。 图 3 单一碳源半合成培养基细菌产量 除7（无木糖）以外的混合培养基都达到近似的QX，7产生的QX值比其它三种高十倍。在木糖培养基中 更低的QX归因于其碳源。所以更少的底物被用作细胞生长。因此，存在葡萄糖的培养基3和7达到最高的QX， 并且没有木糖醇的生产。YX/S也显示含木糖培养基细胞增长低于不含木糖培养基。 很有趣的发现培养基1的菌体数量很少（营养中没有糖的加入）。事实上，与其它培养基相比，这组 培养基的菌体产量是无意义的。这表明(NH4)2SO4, CaCl2.2H2O和麦糠汁只能算作一种营养，而非产能或细

岗开大学微生物发醇工程室倒教学 胞生长的底物。 3时论 目前的工作显示，季也蒙假统酵母消耗葡糖比木糖快。这对于醉母来说具有普希性，葡登糖代谢所 需酶是构成酶，换言之，这些酶是细胞每时每刻都需要的。而且总存在与细胞中（①aes，S如therland 1992》,然而，含葡萄糖的培养基木糖消耗慢于无葡葡糖存在的培养基。这表明葡有糖都分钟制参与木糖 代谢的前Kilian and van Uden1S83:5 pencer--Martins19的4). 帽萄糖和木糖对树胶醛糖存在更为明显的抑制，因为在混合底物培养基中，季也蒙假丝醇母并不消耗 树胶醛糖。这个事实显示葡萄糖和木糖（分别与树胶征糖以10：1和2：1比例存在）抑制了与树胶糖代 谢有关的酶。木糖的这种抑制作用也在其它酵母中被发现即使其含量低于树敢醛糖的1/10。例如。汉最德 巴利酵母①ebaryomces hansenii),当培养基中木糖和树胶径糖比例在4：l时.树胶醛糖同化作用被完 全掉制(G1r1o第.2000)， 树胶醛糖并不被酵母药清耗，它在发酵过程中也不影响木糖和笔萄糖的清耗。它另据报道对下列菌中 的木糖同化有非抑制作用：C tropica/is(1994年斯尔瓦和阿夫沙)，Cid血e1rata(1999年萨哈和 博萨斯特)，Pachysolen tannophilus,nd Pichia stipitis(1988年拜科等. 在目前的工作中观察到一个事实是：在简单糖格养基上，木糖醇分别可以从阿拉的糖和木糖转化而来。 同时，从同拉伯糖转化得到的木糖醇单位体积生产力较低(Q=0.G8g/L,h),这表明，酵母需要很长的时 闻才使合成闪拉伯糖代侧必看的南。 当微生物能够再生从树胶醛糖到木酮糖反应需要的辅助因子时，由树校醛糖生产木糖醛就成为了唯一 可能。在这种情况下，树欧醛糖迅速变成阿2自醇，这种复合物随后技氧化为木糖醛(193年，G0g等)， 木酮糖然后变为木糖醇。有丝酵母商比知假性卧母和Pichia gu11indi被报道能够将树胶醛糖转化 为同粒伯醇(Saha and Bothast 19g6),而D.hamsenii则可以将树胶醛糖转化为木糖醇(Gfrio et al. 2000)。在目前的工作里，季也蒙假丝酵母只清耗树胶征糖和利川树胶醛糖进行发醇，这种戊糖棱川作单 一碳源。国根据马托斯在004年的研究。接种准备在含树胶醛糖的糖混合物培养基上的季也肇假性醇母 在发酵过程中更容易同化这种戊糖从而增加了木糖醇产量。(2000年，G1i0等). 木糖醇的生产没有受到发酵培养基中的树胶整糖的影响，相反，培养基中的树胶醛糖促进了季也蒙假 往醇母的木糖代谢。这种效应在C.tropicalis和P,tannophilus的木糖醇代谢中也有发现(2001年瓦 尔特等人，1990年书自和李)。根暴这些研究，树胶醛糖似平是一个无禁的木糖还原酶诱导酶，同时配进 木糖醇的产量和生产率。 6

南开大学微生物发酵工程案例教学 6 胞生长的底物。 3 讨论 目前的工作显示，季也蒙假丝酵母消耗葡萄糖比木糖快。这对于酵母来说具有普遍性，葡萄糖代谢所 需酶是构成酶，换言之，这些酶是细胞每时每刻都需要的，而且总存在与细胞中（Dawes ， Sutherland 1992）。然而，含葡萄糖的培养基木糖消耗慢于无葡萄糖存在的培养基，这表明葡萄糖部分抑制参与木糖 代谢的酶(Kilian and van Uden 1988; Spencer-Martins 1994)。 葡萄糖和木糖对树胶醛糖存在更为明显的抑制，因为在混合底物培养基中，季也蒙假丝酵母并不消耗 树胶醛糖。这个事实显示葡萄糖和木糖（分别与树胶醛糖以10：1和2：1比例存在）抑制了与树胶醛糖代 谢有关的酶。木糖的这种抑制作用也在其它酵母中被发现即使其含量低于树胶醛糖的1/10。例如，汉逊德 巴利酵母(Debaryomyces hansenii)，当培养基中木糖和树胶醛糖比例在4：1时。树胶醛糖同化作用被完 全抑制(Gírio 等. 2000)。 树胶醛糖并不被酵母菌消耗，它在发酵过程中也不影响木糖和葡萄糖的消耗。它另据报道对下列菌中 的木糖同化有非抑制作用：C. tropicalis(1994 年斯尔瓦和阿夫沙), Candida peltata (1999 年萨哈和 博萨斯特), Pachysolen tannophilus, and Pichia stipitis(1988 年拜科等). 在目前的工作中观察到一个事实是：在简单糖培养基上，木糖醇分别可以从阿拉伯糖和木糖转化而来。 同时，从阿拉伯糖转化得到的木糖醇单位体积生产力较低（Qp=0.08g/L﹒h），这表明，酵母需要很长的时 间才能合成阿拉伯糖代谢必需的酶。 当微生物能够再生从树胶醛糖到木酮糖反应需要的辅助因子时，由树胶醛糖生产木糖醛就成为了唯一 可能。在这种情况下，树胶醛糖迅速变成阿拉伯醇，这种复合物随后被氧化为木糖醛（1983 年，Gong 等）， 木酮糖然后变为木糖醇。有些酵母菌比如假丝酵母和 Pichia guilliermondi 被报道能够将树胶醛糖转化 为阿拉伯醇(Saha and Bothast 1996)，而 D. hansenii 则可以将树胶醛糖转化为木糖醇(Gírio et al. 2000)。在目前的工作里，季也蒙假丝酵母只消耗树胶醛糖和利用树胶醛糖进行发酵，这种戊糖被用作单 一碳源，但根据马托斯在 2004 年的研究，接种准备在含树胶醛糖的糖混合物培养基上的季也蒙假丝酵母 在发酵过程中更容易同化这种戊糖从而增加了木糖醇产量。（ 2000 年，Gírio 等）。 木糖醇的生产没有受到发酵培养基中的树胶醛糖的影响，相反，培养基中的树胶醛糖促进了季也蒙假 丝酵母的木糖代谢。这种效应在 C. tropicalis 和 P. tannophilus 的木糖醇代谢中也有发现（2001 年瓦 尔特等人，1990 年韦伯和李）。根据这些研究，树胶醛糖似乎是一个无偿的木糖还原酶诱导酶，同时促进 木糖醇的产量和生产率

南开大学微生物发醇工程老例教学 (童雪平鞋保) 与树胶整糖不同，发醇培养基中葡萄糖的存在就会影响季也蒙假丝酵母的木糖醇发醇。可能是由干这 种己糖引起了木糖还原酶的部分抑制，面木糖还原酶需要从木糖转化为木糖醇产生的阳来辅助持续再 生。这样的话，一定数量的木糖必策棱用于再生，而核苷酸木糖醇产量也就因此下降了，在以往对季也蒙 假性醇母的木糖酮生产的研究显示，培养基中莲萄糖含量少于木糖浓度的十分之一时，并不影利这种微生 物生产木糖醇（菲利普等人1993年，罗莎等人1998年）。然而，根据现在研究的结果，发酵培养基中葡 萄糖浓度就算低于木糖浓度的五分之一也足以对这种微生物的木糖醇生产起强瓶的抑制作川： 就生物量的构成而言，单一底物培养基上的培养表明，葡萄糖是最利于季也蒙履丝酵母细数生长的底 物。葡萄糖对生物量积累的影响同样技发现于发醉单胞国的培养过程中(2002年劳福德和卢梭)和D. hansenii的培养过程中(2000年塔瓦雷斯等)，在这些研究中，观察到饵胞密度与培养基中的葡萄糖浓 度成正比。而在目前的工作中发现，葡葡糖比木糖更有益于醇母菌的生长，但是在培养基中的浓度却要明 显低于木糖。一些研究报告说。木糖米度低于50z/L时，解母代谢从木糖醇生成慢侵变为细胞团的生成 (ussatt0等2005a:Paraj0等1995年：贵利佩等1993年)。在先的对季也蒙假丝酵母的木糖醇生产的 研究中(2005年穆萨托等)，20w/儿木糖的半固体培养基对应每克木糖又有Q14g的细鞋生长因子(Y/S), 这和口前从17g/L木糖培养基中(YX/S0.15/g葡萄糖)阁到的研究结论是相似的 这些结果表明季也蒙假丝酵母优先消耗葡萄糖有两个原因：培养基中低浓度的葡萄糖和葡萄糖没有转 化为木糖醇。由此可以得出的结论是培养基中适量沫度（约为术糖浓度的十分之一）的树胶醛糖的存在有 利于季也蒙假丝酵母的木糖醇生产，面一定量的葡萄糖（浓度约为木糖浓度的五分之一）就会诚少产量和 可能由于木糖代湘酶被部分钟制导致的木糖醇产量降低。由于一些木糖的半纤维水解液含有接近基至超过 木糖浓度路的葡面糖含量，影响木糖醇生产的一个可能原因就是葡萄糖。解决这个问愿的一种可用方法是 Leathers和Dien于2000年提出的两步发醇法。首先，用于发酵的雏酸在葡萄糖培养基上生长，当葡萄 糖消耗完后，这些细胞会被移除，再接种到这个培养基上的醇母菌就是在只合木糖的培养基上进行发醇了。 根据这些学者的塑法，这种方法对多种复条培养基上的发酵都是有帮助的，特别是受葡萄朝脚制的发酵。 数谢：在这里要特别感CS,FAPESP和CNPg提供的支持与指助， 参考文献 [1]Barbosa MFS.Medeiros VB.Mancilha IM.Schneider H.Lee (1988)Screening of yeasts for production of xylitol from Dxylose and some factors which affect xylitol yield in Candida guilliermondii.J Ind Microbiol 3:241 -251 [2]Bicho PA.Runnals PL.Cunningham JD.Lee H (1988)Induction of xylose reductase and

南开大学微生物发酵工程案例教学 7 （童雪平翻译） 与树胶醛糖不同，发酵培养基中葡萄糖的存在就会影响季也蒙假丝酵母的木糖醇发酵。可能是由于这 种己糖引起了木糖还原酶的部分抑制，而木糖还原酶需要从木糖转化为木糖醇产生的 NADPH 来辅助持续再 生。这样的话，一定数量的木糖必须被用于再生，而核苷酸木糖醇产量也就因此下降了。在以往对季也蒙 假丝酵母的木糖醇生产的研究显示，培养基中葡萄糖含量少于木糖浓度的十分之一时，并不影响这种微生 物生产木糖醇（菲利普等人 1993 年，罗莎等人 1998 年）。然而，根据现在研究的结果，发酵培养基中葡 萄糖浓度就算低于木糖浓度的五分之一也足以对这种微生物的木糖醇生产起强烈的抑制作用。 就生物量的构成而言，单一底物培养基上的培养表明，葡萄糖是最利于季也蒙假丝酵母细胞生长的底 物。葡萄糖对生物量积累的影响同样被发现于发酵单胞菌的培养过程中（2002 年劳福德和卢梭）和 D. hansenii 的培养过程中 （2000 年塔瓦雷斯等）。在这些研究中，观察到细胞密度与培养基中的葡萄糖浓 度成正比。而在目前的工作中发现，葡萄糖比木糖更有益于酵母菌的生长，但是在培养基中的浓度却要明 显低于木糖。一些研究报告说，木糖浓度低于 50g/L 时，酵母代谢从木糖醇生成慢慢变为细胞团的生成 （ Mussatto 等 2005a ; Parajó等 1995 年;费利佩等 1993 年）。在先前对季也蒙假丝酵母的木糖醇生产的 研究中（ 2005 年穆萨托等），20g/L 木糖的半固体培养基对应每克木糖又有 0.14g 的细胞生长因子（YX/S）， 这和目前从 17g/L 木糖培养基中（YX/S=0.15g/g 葡萄糖）得到的研究结论是相似的 这些结果表明季也蒙假丝酵母优先消耗葡萄糖有两个原因：培养基中低浓度的葡萄糖和葡萄糖没有转 化为木糖醇。由此可以得出的结论是培养基中适量浓度（约为木糖浓度的十分之一）的树胶醛糖的存在有 利于季也蒙假丝酵母的木糖醇生产，而一定量的葡萄糖（浓度约为木糖浓度的五分之一）就会减少产量和 可能由于木糖代谢酶被部分抑制导致的木糖醇产量降低。由于一些木糖的半纤维水解液含有接近甚至超过 木糖浓度 5%的葡萄糖含量，影响木糖醇生产的一个可能原因就是葡萄糖。解决这个问题的一种可用方法是 Leathers 和 Dien 于 2000 年提出的两步发酵法。首先，用于发酵的细胞在葡萄糖培养基上生长，当葡萄 糖消耗完后，这些细胞会被移除，再接种到这个培养基上的酵母菌就是在只含木糖的培养基上进行发酵了。 根据这些学者的想法，这种方法对多种复杂培养基上的发酵都是有帮助的，特别是受葡萄糖抑制的发酵。 致谢：在这里要特别感谢 CAPES， FAPESP 和 CNPq 提供的支持与帮助。 参考文献 [1] Barbosa MFS, Medeiros MB, Mancilha IM, Schneider H, Lee H (1988) Screening of yeasts for production of xylitol from Dxylose and some factors which affect xylitol yield in Candida guilliermondii. J Ind Microbiol 3:241–251 [2] Bicho PA, Runnals PL, Cunningham JD, Lee H (1988) Induction of xylose reductase and

南开大学满生物发醇工程室例教学 xylitol dehydrogenase activities in Pachysolen tannophilus and Pichia stipitis on mixed sugars. Appl Emviron Microbiol 54:50-54 [3]Dawes IM.Sutherland IW (1992)Microbfal Physiology.Blackwell Scientifie Publications, London Felipe MGA.Mancilha IM,Yitolo M.Roberto IC,Silva SS.Rosa SAM (1993)Preparation of xylitol by fermentation of a hydrolysate of hemicellulose obtained froa sugarcane bagasse.Braz Arch Biol Technol 36:103-114 [4]GIrio FM,Amaro C.Azinheira H.Pelica F.Amaral-Collaco MT (2000)Polyols production during single and nixed substrate fermentations in Deharyonyces hansenii.Bioresour Technol 71:245-251 [5]Gong CS.Claypool TA,McCraken LD,Maun Ol,Ueng PP,Tsao GT (1983)Comversion of pentoses by yeasts.Biotechnol Bioeng 25:85-102 Kilian SG.van Uden N (1988)Transport of xylose and glucose in the xylose-fermenting yeast Pichia stipitis.Appl Microbiol Biotechnol 27:545-548 [6]Lawford HG.Rousseau JD (2002)Performance testing of Zymomonas mobilis metabolically engineering for cofermentation of glucose,xylose and arabinose.Appl BiocherBiotechnol 98-100:429-448 [7]Leathers TD,Dien BS (2000)Xylitol production from corn fibre hydrolysates by a two-stage fernentation process.Process Biochen 35:765-769 [8]Lee H (1992)Reversible inactivation of D-xylose utilization by Dglucose in the pentose-fernenting yeast Pachysolen tanmophilus.FEMS Microbiol Lett 92:1-4 Matos GS (2004)Adaptacho e reciclagem de celulas de Candida guilliermondii em hidrolisado de bagaco de cana-de-acdcar:efeito sobre as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase. [9]Ph.D.thesis,Faculty of Chenical Engineering of Lorena.Lorena.Brazil Melaja AJ. Hanilainen L (1977)Process for making xylitol.UIS Patent 4.008.285,18 Jun 1975 (published in 15/02/1977)Mussatto SI,Roberto IC (2002)Xylitol:a sweetener with benefits for human bealth. Brax J Pharn Sci 38:401-413 [10]Mussatto SI,Dragone G.Roberto IC (2005a)Influence of the toxic compounds present in brever's spent grain bemicellulosic hydrolysate on xylose-to-xylitol bioconversion by Candida guilliermondii.Process Biochen 40:3801-3806 [11]Mussatto SI.Dragone G,Roberto IC (2005b)Kinetic behavior of Candida guilliermondii yeast during xylitol production fron brewer's spent grain hemicellulosic hydrolysate

南开大学微生物发酵工程案例教学 8 xylitol dehydrogenase activities in Pachysolen tannophilus and Pichia stipitis on mixed sugars. Appl Environ Microbiol 54:50–54 [3] Dawes IM, Sutherland IW (1992) Microbial Physiology. Blackwell Scientific Publications, London Felipe MGA, Mancilha IM, Vitolo M, Roberto IC, Silva SS, Rosa SAM (1993) Preparation of xylitol by fermentation of a hydrolysate of hemicellulose obtained from sugarcane bagasse. Braz Arch Biol Technol 36:103–114 [4] Gírio FM, Amaro C, Azinheira H, Pelica F, Amaral-Collaço MT (2000) Polyols production during single and mixed substrate fermentations in Debaryomyces hansenii. Bioresour Technol 71:245–251 [5] Gong CS, Claypool TA, McCraken LD, Maun CM, Ueng PP, Tsao GT (1983) Conversion of pentoses by yeasts. Biotechnol Bioeng 25:85–102 Kilian SG, van Uden N (1988) Transport of xylose and glucose in the xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Appl Microbiol Biotechnol 27:545–548 [6] Lawford HG, Rousseau JD (2002) Performance testing of Zymomonas mobilis metabolically engineering for cofermentation of glucose, xylose and arabinose. Appl BiochemBiotechnol 98–100:429–448 [7] Leathers TD, Dien BS (2000) Xylitol production from corn fibre hydrolysates by a two-stage fermentation process. Process Biochem 35:765–769 [8] Lee H (1992) Reversible inactivation of D-xylose utilization by Dglucose in the pentose-fermenting yeast Pachysolen tannophilus. FEMS Microbiol Lett 92:1–4 Matos GS (2004) Adaptação e reciclagem de células de Candida guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar: efeito sobre as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase. [9] Ph.D. thesis, Faculty of Chemical Engineering of Lorena, Lorena, Brazil Melaja AJ, Hamäläinen L (1977) Process for making xylitol. US Patent 4.008.285, 18 Jun 1975 (published in 15/02/1977) Mussatto SI, Roberto IC (2002) Xylitol: a sweetener with benefits for human health. Braz J Pharm Sci 38:401–413 [10] Mussatto SI, Dragone G, Roberto IC (2005a) Influence of the toxic compounds present in brewer’s spent grain hemicellulosic hydrolysate on xylose-to-xylitol bioconversion by Candida guilliermondii. Process Biochem 40:3801–3806 [11] Mussatto SI, Dragone G, Roberto IC (2005b) Kinetic behavior of Candida guilliermondii yeast during xylitol production from brewer’s spent grain hemicellulosic hydrolysate

房开大学造生物发醇工程室例教学 Biotechnol Prog 21:1352-1356 [12]Parajo JC.Dominguez H Domnguez JM (1995)Production of xylitol froa raw wood hydrolysates by Debaryomces hansenii NRRL.Y-7426.Bioprocess Eng 13:125-131 [13]Parajo JC,Dominguez H Domnguez JM (1998)Biotechnological production of xylitol. Part 2:operation in culture media made with comercial sugars.Bioresour Technol 65:203-212 [14]Rosa SMA,Felipe WGA,Silva SS,Vitolo M(1998)Xylose reductase production by Candida guilliermondii.Appl Biochem Biotechnol T0(72)127-135 [15]Saha BC,Bothast RJ (1996)Production of L-arabitol from L-arabinose by Candida entomaea and Pichia guilliermondii.ApplMicrobiol Biotechnol 45:299-306 [16]Saha BC,Bothast RJ (1999)Production of xylitol by Candida peltata.J Ind Microbiol Bi0tech22:633-636 [17]Silva S5,Afschar AS (1994)Microbial production of xylitol fro D-xylose using Candida tropicalis.Bioprocess Eng 11:129-134 [18]Spencer-Martins I (1994)Transport of sugars in yeasts:implications in the fermemtation of ligocellulosic materials.Bioresour Techmol 50:51-57 [19]Tavares JM.Duarte LC.Amaral-Collaco MT.Girio FM (2000)The influence of hexoses addition on the fermentation of D-xylose in Debaryomrees hansenii under cont inous cultivation. Enzyme Microb Technol 26:743-747 [20]Nalther T.Bensirisak P.Agblevor FA (2001)The influence of aeration and hemicellulosic sugars on xylitol production by Candida tropicalis.Bioresour Technol 76:213-220 [21]Webb SR,Lee H (1990)Regulation of xylose utilization by hexoses in pentose-fermenting yeast.Biotechnol Adv 8:685-697 Winkelhausen E.Kuzmanowa S (1998)Microbial conversion of D-xylose to xylitol.J Ferment Bioeng 85:1-14 686 9

南开大学微生物发酵工程案例教学 9 Biotechnol Prog 21:1352–1356 [12] Parajó JC, Domínguez H, Domínguez JM (1995) Production of xylitol from raw wood hydrolysates by Debaryomyces hansenii NRRL Y-7426. Bioprocess Eng 13:125–131 [13] Parajó JC, Domínguez H, Domínguez JM (1998) Biotechnological production of xylitol. Part 2: operation in culture media made with commercial sugars. Bioresour Technol 65:203–212 [14] Rosa SMA, Felipe MGA, Silva SS, Vitolo M (1998) Xylose reductase production by Candida guilliermondii. Appl Biochem Biotechnol 70(72):127–135 [15] Saha BC, Bothast RJ (1996) Production of L-arabitol from L-arabinose by Candida entomaea and Pichia guilliermondii. ApplMicrobiol Biotechnol 45:299–306 [16]Saha BC, Bothast RJ (1999) Production of xylitol by Candida peltata. J Ind Microbiol Biotech 22:633–636 [17]Silva SS, Afschar AS (1994) Microbial production of xylitol from D-xylose using Candida tropicalis. Bioprocess Eng 11:129–134 [18]Spencer-Martins I (1994) Transport of sugars in yeasts: implications in the fermentation of lignocellulosic materials. Bioresour Technol 50:51–57 [19] Tavares JM, Duarte LC, Amaral-Collaço MT, Gírio FM (2000) The influence of hexoses addition on the fermentation of D-xylose in Debaryomyces hansenii under continuous cultivation. Enzyme Microb Technol 26:743–747 [20] Walther T, Hensirisak P, Agblevor FA (2001) The influence of aeration and hemicellulosic sugars on xylitol production by Candida tropicalis. Bioresour Technol 76:213–220 [21]Webb SR, Lee H (1990) Regulation of xylose utilization by hexoses in pentose-fermenting yeast. Biotechnol Adv 8:685–697 Winkelhausen E, Kuzmanova S (1998) Microbial conversion of D-xylose to xylitol. J Ferment Bioeng 86:1–14 686