南开大学案例啤酒酵母产酒菌株在不同浓度氮源的合成培养基上的硫化氢和其他芳香化合物的产量_微生物发酵工程.doc_大学文库

微生物发醇工程室例教早库酒酵母产酒商株在不河浓座氨源的合成培养基上的硫化氯和其他芳香化合物的产量 (周健平) 捕要：这个研究的目的是估计在酒精发醇过程中最初含氯量对硫化氢和其也挥发性化合物的产量的筹合作用。基于这个提议，三个商业化的假酒醇母的产酒南株被用于不同氯含量条件下的葡萄汁合成培养基的发醇。硫化氢在发醇过程中进行测定，其他芳香化合物在实验结束后进行分析。培养基中最初的氮源含量与硫化氢总产量具有负相关关系，三个被测菌株的触发水平有所不同，对于522和PYCC402,硫化氯的最高产量出现在培养基中初始氮源含量为67g然1时，而最低水平出现在氨短缺/饥城状态(6防驱 /1)。此外，属于不同化学类别的21种其他芳香化合物通过固相微萃取技术并结合气象表相色进联用找术核认定并定量分析，初始氨源含量比不同醇得菌株对最锋芳香化合物的产量更有决定性的作用。说明营养物质是调节风味物质产量的期里值的有效工具。关键词：醇母，氯源，硫化氢，酿酒，芳香化合物列言硫化氢产量是酿酒业关注的主要问思，因为硫化氢的臭鸡蛋气味在非含低的浓度也会对酒的感官品质有深远的负面作用。在配酒酵母中，硫化氢是硫酸盐还源途径的产物。是含硫氨基酸生物合成的中间产物。含硫氨基酸的生物合成需要来源于细围内氯总量的含氮的碳输体和来源于葡酸盐还原途径的硫化物。因此，硫化氢含量的比率似乎由细胞对含硫氨基酸的雷求和细幽内总氨含量的雀持所控制。在产酒的情况下，硫化氢的产量与几个环境和营养因素有关，也就是基本含硫量中天然的硫化物含量的平均浓度水平 (200/1),提前源加到葡萄中来进行酒精发卧的二氧化硫形式的魔(50-200眼/1)，含硫有机化合物的存在，以及隆生素的短缺。然而，有报道称，硫化氢的含量与可同化的氨源之问的关系不密切。然面，氮源以及前面所提到的哪些因素的作用很大程度上取决于酵母的遗传背景。这给设计策略减少酿清过程中硫化氢的产生带来了困难人们普遍认同酵母菌的种类和同化氯源的能力在决定酒的感官特征上扮演了重要的角色。有机酸、高级醇、乙征、刚类和含硫化合物核认为是清的最重要的感官组成部分，构成了“发醇香”的主要化合物群体。一些有机酸足够易挥发而产生气味。知乙酸（酸味），丙酸（粒味），丁酸（变质奶酪味）。在酒中，只有乙酸的含量可以跨越感凳的门檀，它的产量似平与初始氯源水平呈负相关关系。高级醇侧如异戊醇、戊醇、异丁醇在发酵过程中由相似的生化反应作为制酸的脱骏反应的结果敲生产，这些ā制酸是来尊于氨基酸的转氢基作用（由亮氢酸产生的▣阴异己酸。由螺氢酸产生的ā阴异龙酸，由异亮氨酸产生的ā酮 B甲基戊酸)或者通过1ih途径或糖酵解产生的。这些醇类，在发酵过程中与酸合成了乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸异度酯（类似香蕉味）、己酸乙图、辛酸乙酯（类似苹果味）入、2-乙酸苯乙酯等酯类，对白酒

微生物发酵工程案例教学 1 啤酒酵母产酒菌株在不同浓度氮源的合成培养基上的硫化氢和其他芳香化合物的产量（周健平）摘要：这个研究的目的是估计在酒精发酵过程中最初含氮量对硫化氢和其他挥发性化合物的产量的综合作用。基于这个提议，三个商业化的酿酒酵母的产酒菌株被用于不同氮含量条件下的葡萄汁合成培养基的发酵。硫化氢在发酵过程中进行测定，其他芳香化合物在实验结束后进行分析。培养基中最初的氮源含量与硫化氢总产量具有负相关关系，三个被测菌株的触发水平有所不同。对于 UCD522 和 PYCC4072，硫化氢的最高产量出现在培养基中初始氮源含量为 267mgN /l 时，而最低水平出现在氮短缺/饥饿状态（66 mg N/l）。此外，属于不同化学类别的 21 种其他芳香化合物通过固相微萃取技术并结合气象液相色谱联用技术被认定并定量分析。初始氮源含量比不同酵母菌株对最终芳香化合物的产量更有决定性的作用，说明营养物质是调节风味物质产量的期望值的有效工具。关键词：酵母，氮源，硫化氢，酿酒，芳香化合物引言硫化氢产量是酿酒业关注的主要问题，因为硫化氢的臭鸡蛋气味在非常低的浓度也会对酒的感官品质有深远的负面作用。在酿酒酵母中，硫化氢是硫酸盐还原途径的产物，是含硫氨基酸生物合成的中间产物。含硫氨基酸的生物合成需要来源于细胞内氮总量的含氮的碳前体和来源于硫酸盐还原途径的硫化物。因此，硫化氢含量的比率似乎由细胞对含硫氨基酸的需求和细胞内总氮含量的维持所控制。在产酒的情况下，硫化氢的产量与几个环境和营养因素有关，也就是基本含硫量中天然的硫化物含量的平均浓度水平（200mg/l），提前添加到葡萄中来进行酒精发酵的二氧化硫形式的硫（50–200 mg/l），含硫有机化合物的存在，以及维生素的短缺。然而，有报道称，硫化氢的含量与可同化的氮源之间的关系不密切。然而，氮源以及前面所提到的哪些因素的作用很大程度上取决于酵母的遗传背景，这给设计策略减少酿酒过程中硫化氢的产生带来了困难。人们普遍认同酵母菌的种类和同化氮源的能力在决定酒的感官特征上扮演了重要的角色。有机酸、高级醇、乙醛、酮类和含硫化合物被认为是酒的最重要的感官组成部分，构成了“发酵香”的主要化合物群体。一些有机酸足够易挥发而产生气味，如乙酸（酸味），丙酸（膻味），丁酸（变质奶酪味）。在酒中，只有乙酸的含量可以跨越感觉的门槛，它的产量似乎与初始氮源水平呈负相关关系。高级醇例如异戊醇、戊醇、异丁醇在发酵过程中由相似的生化反应作为α酮酸的脱羧反应的结果被生产，这些α酮酸是来源于氨基酸的转氨基作用（由亮氨酸产生的α酮异己酸，由缬氨酸产生的α酮异戊酸，由异亮氨酸产生的α酮 β甲基戊酸）或者通过 Ehrlich 途径或糖酵解产生的。这些醇类，在发酵过程中与酸合成了乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸异戊酯（类似香蕉味）、己酸乙酯、辛酸乙酯（类似苹果味）、2-乙酸苯乙酯等酯类，对白酒

微生物发醇工程室例教学肆酒以及其他清精饮料中令人输快的水果芬芳做出了重要贡献。在较低的水平内，这些化合物对酒的感官香气的贡献情综复柔。然而，当他们的含量太高时，也被考虑是产生条味的原因。在其他的因素中，氨源含量在发酵过程中通过控制Eh1ih途径、霜防酸和酯类的合成途径影响高级醇和面类的形式。此外，值阁注意的是，这些产生于发酵过程中的化合物的产量在酸酒酵母的月一菌种和同一菌株内仍有所不同。只有最近进行的几项研究测定了氨源对酒中所含芳香化合物的影响。因此，当前工作的目的此在于测定硫化氢的产量以及测定三个不同酸清酵母菌株在氯源条件不同的高糖清精爱醇过程中挥爱性芳香化合物组成的潜在差别。这样，我们研究了在葡萄汁合成培养基上生长的三个广泛使用的商业化酿酒醇母菌株，分批培养，榄仿酿酒的条件，并将初始氯源浓度设定为6、27及40②g/1。关于生长，发酵行为、挥发性化合物生产及式他影响酒的特性的酸酒学特征的知识对于缩选最合适的菌株来生产某种转定味道和风味的清根有用。材料和方法菌株和惟持条件本实验中用到了三个酸清酵母商株。S.cerevisiae UCD522的提供者是Enology Culture Collection, Department of Viticulture and Enology,University of California,Davis.USA.S.cerevisiae CC4on2最切分离于Fermivin的一个样品，这个样晶由Rapidase从购自Portuguese Yeast Culture Colleetion(TCC,New University of Lisbo通，Portugal的工业酒精酵母中分离出来。商业菌株S, G0r0v1sa0C1118悬为活性干酵母购自市场：被测面株根据它门在固体培养基上的潜在产硫化氢能力米第选：(1)C①522（高产），(2)CC4072(产量居于平均值)，(3)C1118(低产X醇母菌培养于4℃下的醇母浸出粉陈葡萄糖瑞脂培养基(YD》斜面上，培养基中包括：葡面糖20/1，蛋白鞋10/1，醇母提取物5g/1,琼脂20g/1。菌种在使用前转移至新的阳斜面25℃培养24小时. 培养基使用一种以前核Australian Wine Research【nstitute的Henschke和J1raek描述过的葡萄汁培养基(GJ国)，并精作修政。它化学成分清楚，组成与奥型领萄计类似。缅萄糖(00g/1)是唯一的碳源和能源，不同浓度的氨薄(66agN/1,267V1,402g/1)以磷酸二氢铵的形式提供，以便检测氮的消耗情况。此外。根据围际葡萄与葡萄酒同的规定。按以磷酸盐暖硫酸盐的形式在法定的1O00w/小范围内被酿清者广泛应用于提高葡萄汁中的氯源含量。培养基在过滤释南之前用飞州将州值调至37：接种和发醉条件在所有的实验中，种子培养物都是在提前在1001的据瓶中过夜培养的酵母百，括T0l与文章各处提到的成分相同的同种塔养基。培养在25℃的定轨据床上进行，转速为150难。预培养是为了得到原始种群为5×10C/l的实验培养物。 2

微生物发酵工程案例教学 2 啤酒以及其他酒精饮料中令人愉快的水果芬芳做出了重要贡献。在较低的水平内，这些化合物对酒的感官香气的贡献错综复杂。然而，当他们的含量太高时，也被考虑是产生杂味的原因。在其他的因素中，氮源含量在发酵过程中通过控制 Erhlich 途径、脂肪酸和酯类的合成途径影响高级醇和酯类的形式。此外，值得注意的是，这些产生于发酵过程中的化合物的产量在酿酒酵母的同一菌种和同一菌株内仍有所不同。只有最近进行的几项研究测定了氮源对酒中所含芳香化合物的影响。因此，当前工作的目的就在于测定硫化氢的产量以及测定三个不同酿酒酵母菌株在氮源条件不同的高糖酒精发酵过程中挥发性芳香化合物组成的潜在差别。这样，我们研究了在葡萄汁合成培养基上生长的三个广泛使用的商业化酿酒酵母菌株，分批培养，模仿酿酒的条件，并将初始氮源浓度设定为 66、267 及 402mgN/l。关于生长、发酵行为、挥发性化合物生产及其他影响酒的特性的酿酒学特征的知识对于筛选最合适的菌株来生产某种特定味道和风味的酒很有用。材料和方法菌株和维持条件本实验中用到了三个酿酒酵母菌株。S.cerevisiae UCD522 的提供者是 Enology Culture Collection, Department of Viticulture and Enology,University of California, Davis, USA 。S. cerevisiae PYCC4072 最初分离于 Fermivin 的一个样品，这个样品由 Rapidase 从购自 Portuguese Yeast Culture Collection(PYCC), New University of Lisbon, Portugal 的工业酒精酵母中分离出来。商业菌株 S. cerevisiae EC1118 最为活性干酵母购自市场。被测菌株根据它们在固体培养基上的潜在产硫化氢能力来筛选：（1）UCD522（高产），（2）PYCC4072（产量居于平均值），（3）EC1118（低产）。酵母菌培养于 4℃下的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）斜面上，培养基中包括：葡萄糖 20g/l，蛋白胨 10g/l，酵母提取物 5g/l，琼脂 20g/l。菌种在使用前转移至新的 YPD 斜面 25℃培养 24 小时。培养基使用一种以前被 Australian Wine Research Institute 的 Henschke 和 Jiranek 描述过的葡萄汁培养基（GJM），并稍作修改。它化学成分清楚，组成与典型葡萄汁类似。葡萄糖（200g/l）是唯一的碳源和能源，不同浓度的氮源（66mgN/l，267mgN/l，402mgN/l）以磷酸二氢铵的形式提供，以便检测氮的消耗情况。此外，根据国际葡萄与葡萄酒局的规定，铵以磷酸盐或硫酸盐的形式在法定的 1000mg/l 范围内被酿酒者广泛应用于提高葡萄汁中的氮源含量。培养基在过滤除菌之前用 NaOH 将 pH 值调至 3.7。接种和发酵条件在所有的实验中，种子培养物都是在提前在 100ml 的摇瓶中过夜培养的酵母菌，包括 70ml 与文章各处提到的成分相同的同种培养基。培养在 25℃的定轨摇床上进行，转速为 150rpm。预培养是为了得到原始种群为 5×105 CFU/ml 的实验培养物

微生物发精工程室例教学发醇在装有2/3体积液体的的20摇瓶中进行，侧面设有口并用橡胶隔膜封住，在0℃下的定轨摇宋中以120理的转速进行厌氧发酵。（构雅男）（陈静修政）发酵采用检测重量损失检测二氧化震生产量。使用注射器系统完成无南取样。为了避免在系统中中度积累，针新入针孔支料物中。每个长预瓶被檬胶塞关团，允许发酵气体通过玻璃管连接到双向阀特克松油管选殿：另一瑞的油管是连接管，0毫升的排气阀解决创造一个发醇镜的硫化氢的排气阀。每4小时，每个长额瓶是从振动筛，断开排气阀，称重，并连接到一个新的排气罚。采样来确定评估每日发醇和生长的参数。长颈凰在采样前以相同的性质进行授拌。年底酒精发解是使用C1 initest片（罗民）来确定。此时，样本来自不同发醇培养基，芳香族化合物生产的固相微萃取（固相微萃取）结合气相色谱，质谱(GC 一s法)进行谛遮。此外，活细鞋数目，培养物干重，残糖和氨的含量测定在所有实验中起决定性作用。所有实验重复至少3次，所有报告的数据是平均值。测定活细脑数目和培养物干重光密度(80■)的适当稀释培养物样品核用作测定酵母细胞的生长，样品2×50和/减3×15 毫升在预重管中2300g离心中10分钟，洗两次重藤水，在100℃干燥24h后，移重前存锗在一个干燥器。重复三次，限制楚别在1%内· 测定血糖浓度葡萄糖由2,4一二硝基苯甲酸(S)的方法米定量。测定铵铵计算使用进行了连线蓬出分析系统（采样器，泵。透析单位，单位按，光度计和记录系统）。铵计算所依据的正如先前贝特洛描述的方法。酿酒参数测定总二氧化硫。挥发酸和乙醇生产被国际官方葡萄酒帆构的报道所决定。疏化氢测定正如Jak所描述的，酵母培养硫化氢的释放量决定酵母培养培养的有颜色规律，以下选择性收集发醇气体与区分发卧镇和硫化物俘获系统，解决方案是用智停是氢氧化镊暂停排气，其中载有5,59/几， CdS01.820和15mol/L氢氧化钠.按试剂载37.5mol/L,N-二乙基对苯二胶。盐酸(Sigm,圣路号斯，美国)在9,12©1/儿浓度硫酸，三氯化铁溶液(60%/胃型)漆加前使用，这种混合物(325触1) 加至10毫升的混合溶液中，故入30毫升爆：和瓶，立即关闭和大力起动3%经过1小时在室温下放置，样品的吸光度测量62钠米。硫化氯含量，使用校准由线准答与已知数量的硫化物在一系列的0-12克完整计算硫化氢合量，根据阿克璃和里斯等人所描述的方法。四相激萃取程序和GC一S分析 3

微生物发酵工程案例教学 3 发酵在装有 2/3 体积液体的的 250ml 摇瓶中进行，侧面设有口并用橡胶隔膜封住，在 20℃下的定轨摇床中以 120rpm 的转速进行厌氧发酵。（郝雅男）（陈静修改）发酵采用检测重量损失检测二氧化碳生产量。使用注射器系统完成无菌取样。为了避免在系统中中度积累，针插入针孔支持物中。每个长颈瓶被橡胶塞关闭，允许发酵气体通过玻璃管连接到双向阀特克松油管逃脱；另一端的油管是连接管，10 毫升的排气阀解决创造一个发酵锁的硫化氢的排气阀。每 24 小时，每个长颈瓶是从振动筛，断开排气阀，称重，并连接到一个新的排气阀。采样来确定评估每日发酵和生长的参数。长颈瓶在采样前以相同的性质进行搅拌。年底酒精发酵是使用 Clinitest 片（罗氏）来确定。此时，样本来自不同发酵培养基，芳香族化合物生产的固相微萃取（固相微萃取）结合气相色谱，质谱（ GC - MS 法）进行筛选。此外，活细胞数目，培养物干重，残糖和氮的含量测定在所有实验中起决定性作用。所有实验重复至少 3 次，所有报告的数据是平均值。测定活细胞数目和培养物干重光密度（ 660 nm ）的适当稀释培养物样品被用作测定酵母细胞的生长。样品 2 ×50 和/或 3×15 毫升在预重管中 2300g 离心中 10 分钟，洗两次重蒸水，在 100 ℃ 干燥 24 h 后，称重前存储在一个干燥器。重复三次，限制差别在 1 ％内。测定血糖浓度葡萄糖由 2,4 -二硝基苯甲酸（ DNS ）的方法来定量。测定铵铵计算使用进行了连续流出分析系统（采样器，泵，透析单位，单位铵，光度计和记录系统）。铵计算所依据的正如先前贝特洛描述的方法。酿酒参数测定总二氧化硫，挥发酸和乙醇生产被国际官方葡萄酒机构的报道所决定。硫化氢测定正如 Jiranek 所描述的，酵母培养硫化氢的释放量决定酵母培养培养的有颜色规律。以下选择性收集发酵气体与区分发酵锁和硫化物俘获系统。解决方案是用暂停是氢氧化镉暂停排气，其中载有 5.59mmol/L， CdSO4 .8H2O 和 15mmol/L 氢氧化钠。胺试剂载 37.5mmol/L ， N -二乙基对苯二胺。盐酸（Sigma，圣路易斯，美国）在 9.12mmol/L 浓度硫酸，三氯化铁溶液（ 60 ％W/ W 型）添加前使用。这种混合物（ 325μl）加至 10 毫升的混合溶液中，放入 30 毫升螺旋帽瓶，立即关闭和大力摇动 30s 经过 1 小时在室温下放置，样品的吸光度测量 672 纳米。硫化氢含量，使用校准曲线准备与已知数量的硫化物在一系列的 0-12 克完整计算硫化氢含量，根据阿克瑞和里斯等人所描述的方法。固相微萃取程序和 GC - MS 分析

微生物发醇工程室例教早圆相激萃取该项研究中所用的纤维均涂有聚二甲基硅氧统（聚硅氧统），100μ■：并由Selc0(B110 fonte, 美国宾夕法尼亚州)提供·还持有从同一个供应商(Supelco,Bellefonte,美国宾夕法尼亚州) 提供的用于人工注射的仪器。色谦条件色谱分析深用了Agilent6890N气相色谱仪配备了5973N质语仪。目标组分使用Innowax毛细管柱进行分离，30米×a.25毫米厚度05un的散(Agilent,Santa C1ara加州，CA,美国)。柱子绿特在40℃5分钟后，以4℃/in升A到200°C,然后以10℃/分钟升到240℃时，氢气作为载气以34c/s的平均线速度保持15分钟。一个0.75毫米的班线速度被使用和分析的在分流模式.所有质谱按要求电子碰撞(T)在70N的核式，充分利用扫描扫描范围2820原子质量单位，在6.12/s率扫描。区分所有化合物，通过比较大规模质谱和保留指数与那些真正的标准米确认。丙酸乙酯(99%)，乙基2 ethyIb如tyrate(95%),异茂醇(98.5%)，己酸乙酯(99%)，芳樟醇(97%)， 1率醇(9A.5%),丁酸(9羽%)，乙姿(9明%)，异戊酸酸(98%)，丁二酸二乙酯 (99%),己酸(98%)，辛酸酸(98%)，癸酸(99.5%》·和2-辛醇(99.5%)提供的盐(S1gm-A1dr1ch公司化学有限责任公司，南泰因海姆，德国)·乙酸乙酯(9的，5%)，丁酸乙酯(98⅓)，乙酸异戊酯(8%)，乙基0eta0ate(98%)·2-茶乙基酯(99%)·2-苯乙醇(99%) 米自默克公司（默克，Danstadt，德国）·乙基异丁酸(99%)和乙基戊酸(98%)米自奥尔德里奇(Sia一A1 drich公司化学有限责任公司，镜泰因海姆，德国)· 该化合物的定量采用，选择离子监测模式，通过选择每种化合物中最奥型的离子如下：乙酸乙酯 (43)，乙丙酸(57》，乙异(43+71)，丁酸乙酯(71)，乙20t1b加tyrate(57+ 102),乙基2酸(88)，乙酸异戊酯(43)，异戊醇(55)，己酸乙酯《88)，乙0ctan0ate (8器），芳龄醇(71+93)，1-辛醇(55+6)，丁酸(60)，乙癸(83)，异戊酸酸(0)，丁二酸二乙酯(101)，2-苯乙基情酸(104)，己酸(60)，2-苯乙醇(91)，辛酸（阅），和癸酸(3)·为了消除由于样品中基质（特别是乙醇含量）的微小不同所造成的提取中的效率变化，内部标准化使用2一幸醇的内部标准适用于量化分析物。 (花文颗修政) 四相激萃取因相微蓉取根据略微修改的前述方法速行的。样品的准备方面是对于10的样品（合成酒精溶液），加入4gNaC1的10L内部标准液(2-辛醇，200μgl),转移到40L三角瓶中(Supe1eoP/27181)并用

微生物发酵工程案例教学 4 固相微萃取该项研究中所用的纤维均涂有聚二甲基硅氧烷（聚硅氧烷），100μm，并由 Supelco （ Bellefonte ，美国宾夕法尼亚州）提供。还持有从同一个供应商（ Supelco ， Bellefonte ，美国宾夕法尼亚州）提供的用于人工注射的仪器。色谱条件色谱分析采用了 Agilent6890 N 气相色谱仪配备了 5973 N 质谱仪。目标组分使用 Innowax 毛细管柱进行分离， 30 米×0.25 毫米厚度 0.5μm 的胶（Agilent，Santa Clara 加州， CA ，美国）。柱子保持在 40 ℃ 5 分钟后，以 4 ℃/min 升高到 200° C ，然后以 10 ℃/分钟升高到 240 ℃ 时，氦气作为载气以 34cm/s 的平均线速度保持 15 分钟。一个 0.75 毫米的班线速度被使用和分析的在分流模式。所有质谱被要求电子碰撞（ET）在 70 eV 的模式，充分利用扫描扫描范围 26-250 原子质量单位，在 6.12m/s 率扫描。区分所有化合物，通过比较大规模质谱和保留指数与那些真正的标准来确认。丙酸乙酯（ 99 ％），乙基 2 methylbutyrate （ 95 ％），异戊醇（ 98.5 ％），己酸乙酯（ 99 ％），芳樟醇（ 97 ％）， 1 辛醇（ 99.5 ％），丁酸（ 99 ％），乙癸（ 99 ％），异戊酸酸（ 98 ％），丁二酸二乙酯（ 99 ％），己酸（ 98 ％），辛酸酸（ 98 ％），癸酸（ 99.5 ％），和 2 -辛醇（ 99.5 ％）提供的盐（ Sigma - Aldrich 公司化学有限责任公司，施泰因海姆，德国）。乙酸乙酯（ 99.5 ％），丁酸乙酯（ 98 ％），乙酸异戊酯（ 98 ％），乙基 octanoate （ 98 ％）， 2 -苯乙基酯（ 99 ％）， 2 -苯乙醇（ 99 ％）来自默克公司（默克， Damstadt ，德国）。乙基异丁酸（ 99 ％）和乙基戊酸（ 98 ％）来自奥尔德里奇（ Sigma - Aldrich 公司化学有限责任公司，施泰因海姆，德国）。该化合物的定量采用，选择离子监测模式，通过选择每种化合物中最典型的离子如下：乙酸乙酯（ 43 ），乙丙酸（ 57 ），乙异（ 43 + 71 ），丁酸乙酯（ 71 ），乙 2 methylbutyrate （ 57 + 102 ），乙基戊酸（ 88 ），乙酸异戊酯（ 43 ），异戊醇（ 55 ），己酸乙酯（ 88 ），乙 octanoate （ 88 ），芳樟醇（ 71 + 93 ）， 1 -辛醇（ 55 + 56 ），丁酸（ 60 ），乙癸（ 88 ），异戊酸酸（ 60 ），丁二酸二乙酯（ 101 ）， 2 -苯乙基醋酸（ 104 ），己酸（ 60 ）， 2 -苯乙醇（ 91 ），辛酸（ 60 ），和癸酸（ 73 ）。为了消除由于样品中基质（特别是乙醇含量）的微小不同所造成的提取中的效率变化，内部标准化使用 2 -辛醇的内部标准适用于量化分析物。（范文颖修改）固相微萃取固相微萃取根据略微修改的前述方法进行的。样品的准备方面是对于 10mL 的样品（合成酒精溶液），加入 4gNaCl 的 10mL 内部标准液（2-辛醇，200μgl-1），转移到 40mL 三角瓶中（Supelco P/N27181）并用

微生物发醇工程室例教学案四氟乙烯面硅密封处理。在提家步黑之前。样品要在20+-1摄氏度下平衡10阳n:然后向三角瓶中搭入 0s纤维质，并使之接触样品，然后在常温下用磁力规并器(30Op阳)授并米提60▣in,保证温度和搅并速半不变。然后将纤维质从样品中移出，插入气相色语仅，在270摄氏度下热脱用《分瓷模式)10▣ 后便得出色谱分析结果。标准品的制备及四相徽萃取纤维展校准单一标准的挥发性化合物的储各液(Ir/v),即将每种化合物溶于纯酒精《erck LiChrosolv)而制成。工作液先前已经准备完了，即用11.5跳清精溶液混合的，包括清石酸(3g1)及酒石酸氢钾(3g1-1), 然后用Na0用调为队2，工作液中成分分析如下：乙酸乙图(501-1)，丙酸乙酯(500μg),异丁酸乙酯(2004x1),丁酸乙酯(350=g1),乙二酸甲乙酯(25μx1),度酸乙酯(25z1),乙酸异戊酯 (3.5ag1-1),异戊醇(400ag1-1),己酸乙酯(400μgl),辛酸Z乙酯(300#g),芳特醇《50：1)， 1-辛醇(5041)，丁酸(500=g1),癸酸乙酯(200“g1'),异发酸(2g1-1),丁二酸二乙酯(50μ x1),2苯乙基酯(2x1-1),己酸(5ag1-1),乙基苯(150gl-1),辛酸(61-1)，癸酸(5ag1-1). 这个溶液被用于高浓度的校准标准，其它六个校准溶液是由该溶液用酒精溶液稀释面来。对于纤维质校准溶液来说。所有的校准液都是用GC-5方法并用和发酵GM样品一样的周相微萃取技术经过三次平衡测量得出的。统计分析工业设计实验用米分析葡萄汁初始氨浓度（三个水平上）对发醇的影响和酵母茵系（三个菌系）的芳香化合物产生量，统计分析使用国家统计7.0软件(StatSoft公可，200年)述行，并使用了Tukey HSD 测试方法。 (瓶文瓢) 结果氯浓度和硫化氢的产量的关系及它对菌体生长和发醇的影响，在对5.cerevisiae的三种障酒解母南系的定量培养酒精发酵中的S产生量的佔计中，在人工葡萄汁培养基条件下，模拟自然状态下的酒精发酵。如到培养基中的可吸收的氯源量是根据以前实验室获得的数据而决定的.并用S.cerevis1a0P0C40?2生长及发醇中氨浓度的量米分类。与比同时，已经建立以下氯浓度的三种发醇条件：(1)661是导致缓慢发酵的最高浓度(28-2塑天后获得完全干燥南)，(2)在适当的时间和条件下，67g1'是销精完全发酵所需的氯浓度，(3)当在清精发酵结束时仍有一些氨在发酵培养基中，02眼1是发酵的最大氨浓度。为了正确的分析氨浓度对昆S释放量的影响。初始硫含量只是所有培养基中加的0,7H0(1.23g)并且在此之前没有向发酵系统中加亚硫酸盐。从整体发酵工业米看，每个商系在三种实验条件下的生长方面及硫化氢产生量情况如下图表1、2,3 5

微生物发酵工程案例教学 5 聚四氟乙烯面硅密封处理。在提取步骤之前，样品要在 20+-1 摄氏度下平衡 10min。然后向三角瓶中插入 PDMS 纤维质，并使之接触样品，然后在常温下用磁力搅拌器（300rpm）搅拌来抽提 60min，保证温度和搅拌速率不变。然后将纤维质从样品中移出，插入气相色谱仪，在 270 摄氏度下热脱附（分流模式）10min 后便得出色谱分析结果。标准品的制备及固相微萃取纤维质校准单一标准的挥发性化合物的储备液（1%v/v），即将每种化合物溶于纯酒精（Merck LiChrosolv）而制成。工作液先前已经准备完了，即用 11.5%酒精溶液混合的，包括酒石酸（3gl-1）及酒石酸氢钾（3gl-1），然后用 NaOH 调为 pH3.2，工作液中成分分析如下：乙酸乙酯（50mgl-1），丙酸乙酯（500μgl-1），异丁酸乙酯（200μgl-1），丁酸乙酯（350μgl-1），乙二酸甲乙酯（25μgl-1），戊酸乙酯（25μgl-1），乙酸异戊酯（3.5mgl-1），异戊醇（400mgl-1），己酸乙酯（400μgl-1），辛酸乙酯（300μgl-1），芳樟醇（50μgl-1）， 1-辛醇（50μgl-1），丁酸（500μgl-1），癸酸乙酯（200μgl-1），异戊酸（2mgl-1），丁二酸二乙酯（50μ gl-1），2- 苯乙基酯（2mgl-1），己酸（5mgl-1），乙基苯（150mgl-1），辛酸（6mgl-1），癸酸（5mgl-1）。这个溶液被用于高浓度的校准标准，其它六个校准溶液是由该溶液用酒精溶液稀释而来。对于纤维质校准溶液来说，所有的校准液都是用 GC-MS 方法并用和发酵 GJM 样品一样的固相微萃取技术经过三次平衡测量得出的。统计分析工业设计实验用来分析葡萄汁初始氮浓度（三个水平上）对发酵的影响和酵母菌系（三个菌系）的芳香化合物产生量。统计分析使用国家统计 7.0 软件（StatSoft 公司，2004 年）进行，并使用了 Tukey HSD 测试方法。（范文颖）结果氮浓度和硫化氢的产量的关系及它对菌体生长和发酵的影响。在对 S.cerevisiae 的三种啤酒酵母菌系的定量培养酒精发酵中的 H2S 产生量的估计中，在人工葡萄汁培养基条件下，模拟自然状态下的酒精发酵。加到培养基中的可吸收的氮源量是根据以前实验室获得的数据而决定的,并用 S.cerevisiaePYCC4072 生长及发酵中氮浓度的量来分类。与此同时，已经建立以下氮浓度的三种发酵条件：（1）66mg l-1 是导致缓慢发酵的最高浓度（28-29 天后获得完全干燥菌），（2）在适当的时间和条件下，267mg l-1 是酒精完全发酵所需的氮浓度，（3）当在酒精发酵结束时仍有一些氮在发酵培养基中,402mg l-1 是发酵的最大氮浓度。为了正确的分析氮浓度对 H2S 释放量的影响，初始硫含量只是所有培养基中加的 MgSO47H2O（1.23gl-1）并且在此之前没有向发酵系统中加亚硫酸盐。从整体发酵工业来看,每个菌系在三种实验条件下的生长方面及硫化氢产生量情况如下图表 1、2、3

微生物发酵工程室例教学及表格1。结果表明当培养基中氯浓度保持在66g(导玫缓慢爱酵的最高浓度，菌系CD522(图表1) 在576励后能够完全酒精发酵。面南系0C072和C1118(图表2a,3a)直至63励仍没有达到完全的糖酵解（表格1），残图约13及11g管萄糖。并且，在发酵结束后细围话性仍旧靓高（在9消左右。这里没给出具体数据).在氮浓度为267g1的培养基中，菌系CD522和门0C4072表现的很相似，所有的有效氨源都是在4h之后开始被消耗的，并且在两个商系中对于生长及发醇参数的获得值也近平相同（表格1）。菌系C1118表现的丰常不可。它消耗的氨量一一和发醇范围密切相关的系数一一要远小于其他两组《图表3站，表格1).将氯的初浓度从267g1'改为402对CD522和PY0C4072的生长和发酵模式没有任何影响（图表6，C,2弘，©），然面对于醇母菌系C1118米说，其生长和发酵率的增长是可以观察到的（表格》。尽管C1118菌系在最锋生物团成分上有些许不同（图表1e,2,3c),总的来说实验中所有爵母菌系的发极式军非常相似。所有的发酵均在培养基内氮源没有耗尽的1料小时内完成的。并且这在三种简系中没有观察到任何氨源使用量上的差别。在发酵过程中记录的S产生量中可以看到，不同商系的S产生量的变化和有效氮量的产生有关系 (图表1,2,3)。和在南系CD522和0C4072中相反，对于南系EC1118(产生5少的两系》来说，是可以观察到培养基中初始氨源和总的HS产生量之何的关系的（表格1）。然面，对所有情况研究表明，这个菌系的产萄化物水平一般情况下是被忽略的（图表3：℃），面心072在发醇过程中分别在低浓度的和足够的氨水平，即66和67g-1水平下，硫的释放量在氯量减少时达到顶峰。在培养基中添加的氨浓度为02g1-1(保持培养基中氯浓度为70ag1-1)时（表格1），没有明显的HS产生（图表2c》.然而对于 C522米说，其至当氨过量时也可以检测到显著的品S释放。对于CC072米说，当培养基中初始氨浓度分别为66和267g-1时，24和48小时后，德化物产生量跟醇母细胞消耗的氮量紧紫联系在一起（图表1a,b)。 6

微生物发酵工程案例教学 6 及表格 1。结果表明当培养基中氮浓度保持在 66mgl-1（导致缓慢发酵的最高浓度），菌系 UCD522（图表 1）在 576h 后能够完全酒精发酵。而菌系 PYCC4072 和 EC1118（图表 2a，3a）直至 696h 仍没有达到完全的糖酵解（表格 1），残留约 13 及 11g 葡萄糖。并且，在发酵结束后细胞活性仍旧很高（在 97%左右，这里没给出具体数据）。在氮浓度为 267mgNl-1 的培养基中，菌系 UCD522 和 PYCC4072 表现的很相似，所有的有效氮源都是在 48h 之后开始被消耗的，并且在两个菌系中对于生长及发酵参数的获得值也近乎相同（表格 1）。菌系 EC1118 表现的非常不同，它消耗的氮量——和发酵范围密切相关的系数——要远小于其他两组（图表 3b，表格 1）。将氮的初浓度从 267mgl-1 改为 402mgl-1对 UCD522 和 PYCC4072 的生长和发酵模式没有任何影响(图表 1b,c,2b,c),然而对于酵母菌系 EC1118 来说，其生长和发酵率的增长是可以观察到的(表格 1)。尽管 EC1118 菌系在最终生物团成分上有些许不同（图表 1c，2c，3c），总的来说实验中所有酵母菌系的发酵模式都非常相似。所有的发酵均在培养基内氮源没有耗尽的 144 小时内完成的，并且这在三种菌系中没有观察到任何氮源使用量上的差别。在发酵过程中记录的 H2S 产生量中可以看到，不同菌系的 H2S 产生量的变化和有效氮量的产生有关系（图表 1，2，3）。和在菌系 UCD522 和 PYCC4072 中相反，对于菌系 EC1118（产生 H2S 少的菌系）来说，是可以观察到培养基中初始氮源和总的 H2S 产生量之间的关系的（表格 1）。然而，对所有情况研究表明，这个菌系的产硫化物水平一般情况下是被忽略的（图表 3a-c）。而 PYCC4072 在发酵过程中分别在低浓度的和足够的氮水平，即 66 和 267mgl-1 水平下，硫的释放量在氮量减少时达到顶峰。在培养基中添加的氮浓度为 402mgl-1（保持培养基中氮浓度为 70mgl-1）时（表格 1），没有明显的 H2S 产生（图表 2c）。然而对于 UCD522 来说，甚至当氮过量时也可以检测到显著的 H2S 释放。对于 PYCC4072 来说，当培养基中初始氮浓度分别为 66 和 267 mgl-1 时，24 和 48 小时后，硫化物产生量跟酵母细胞消耗的氮量紧紧联系在一起（图表 1a，b）

南开大学 案例 啤酒酵母产酒菌株在不同浓度氮源的合成培养基上的硫化氢和其他芳香化合物的产量_微生物发酵工程

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