根据浮力密度并应用密度依赖的细胞分离技术分离海生细茵 Katsuyuki Inoue,Masahiko Nishimura,Binaya B.Nayak,and Kazuhiro Kogure Ocean Research Institute.The University of Tokyo,Nakano,Tokyo 161-8639,Japan,and Central Institute of Fisheries Education.Seven Bungalows.Versova,Munbai 400 061.India 本次研究的目的是测试一生天然海生细菌种群是否存在验特的的浮力密度，从而可以用密度依赖的细 胞分离（心C5)方法来分离。我们首先浓增一个天然细阗集合体来收集足够数量的细出现在高液度部分， 反之那生壁细胞菌属一产黄菌属一报杆菌属在的浓度部分。我门还利用三种海生细菌（低密度，中等密度， 高密度)胞。我们用0CS方法把它们分成三部分，每部分的群落结构由贡光爆位杂交分开。古生菌细融趋 向于的浮力密度计算它们门的沉积速度。它们的沉积速度大的为10,20,30/h,当细南之间的不同成分被 看作很小时，这些速度存在生态学暗示。据我们所知，这是关于自然海生细恼的浮力密度的第一篇报告。 浮力密度是一个水生单细胞生物体的基本物理特性，例如浮游植物和细商。对浮游植物米说，这个参 数必须在考虑沉积速度的时说明。国是对于海生细南并不需要考虑沉积速度，因为海生细南的浮力密度的 暗示并不明显。 浮力案度的不同能被用来分离微粒，心C5方法已经被应用于实验室细菌培养。例如，不网生理特征的 细南利用这个方法得到了成功分离，因为生理的变化改变细胞的组分以及浮力密度。心C5方法绝大部分用 于饨牌培养，只有一次用于天然培养。据我们所知，只有一个研究运用C5方法从经过2-(4-苯基)一3 一(4一销基苯)一5一苯基一州氯化四唑(1NT)复期处理的天然海水中的稳定细胞中分离活性细围。活性 细胞上的甲暨沉积物增如了它们的密度，从得使活性细胞有可能利用OCS方法分离。 当细菌的行为被看作微尺度时，天然细茵群落的浮力密度存在生态学暗示。天然细菌群落包括生理学 上的和分类学上的不同的类群的细胞。但是这两个因素如何明最的影响每一类群的的浮力密度还不清楚。 因为天然海水的营养水平通常较低，并且恒定（大约1gL):没有或者银少细胞处在符合实验室中达到 的指数生长阶段的生理状态。在天然细菌群体中，生理状态的变化不像包含廷迟期，对数期，稳定期的成 批培养的细南那么的大。因此。我们假定至少一线种群的独特的浮力密度可以被测算出来，这些细胞就有 可能利用DDC5方法分离 在这个研究中，我们首先浓缩一个天然细面群体以收集足够数量的饵鞋，用CS方法把它们分成三部 分，每部分的群落结构由荧光原位桑交(F引S)区分。古生南细胞趋向于出现在高浓度部分，反之那些零 细胞衡属一产黄菌属一双杆南属在的浓度部分。据我门所知，这是关于自燃海生细嘴的浮力帝度的第一篇报 告。 材料和方法
根据浮力密度并应用密度依赖的细胞分离技术分离海生细菌 Katsuyuki Inoue, Masahiko Nishimura, Binaya B. Nayak, and Kazuhiro Kogure Ocean Research Institute, The University of Tokyo, Nakano, Tokyo 164-8639, Japan, and Central Institute of Fisheries Education, Seven Bungalows, Versova, Mumbai 400 061, India 本次研究的目的是测试一些天然海生细菌种群是否存在独特的的浮力密度，从而可以用密度依赖的细 胞分离（DDCS）方法来分离。我们首先浓缩一个天然细菌集合体来收集足够数量的细出现在高浓度部分， 反之那些噬细胞菌属-产黄菌属-拟杆菌属在的浓度部分。我们还利用三种海生细菌（低密度，中等密度， 高密度）胞。我们用DDCS方法把它们分成三部分，每部分的群落结构由荧光原位杂交分开。古生菌细胞趋 向于的浮力密度计算它们的沉积速度。它们的沉积速度大约为10，20，30m/h，当细菌之间的不同成分被 看作很小时，这些速度存在生态学暗示。据我们所知，这是关于自然海生细菌的浮力密度的第一篇报告。 浮力密度是一个水生单细胞生物体的基本物理特性，例如浮游植物和细菌。对浮游植物来说，这个参 数必须在考虑沉积速度的时说明。但是对于海生细菌并不需要考虑沉积速度，因为海生细菌的浮力密度的 暗示并不明显。 浮力密度的不同能被用来分离微粒，DDCS 方法已经被应用于实验室细菌培养。例如，不同生理特征的 细菌利用这个方法得到了成功分离，因为生理的变化改变细胞的组分以及浮力密度。DDCS 方法绝大部分用 于纯粹培养，只有一次用于天然培养。据我们所知，只有一个研究运用 DDCS 方法从经过 2-(4-苯基)－3 －（4－硝基苯）－5-苯基－2H-氯化四唑(INT)短期处理的天然海水中的稳定细胞中分离活性细胞。活性 细胞上的甲暨沉积物增加了它们的密度，从而使活性细胞有可能利用 DDCS 方法分离。 当细菌的行为被看作微尺度时，天然细菌群落的浮力密度存在生态学暗示。天然细菌群落包括生理学 上的和分类学上的不同的类群的细胞，但是这两个因素如何明显的影响每一类群的的浮力密度还不清楚。 因为天然海水的营养水平通常较低，并且恒定（大约1mg/L）。没有或者很少细胞处在符合实验室中达到 的指数生长阶段的生理状态。在天然细菌群体中，生理状态的变化不像包含延迟期，对数期，稳定期的成 批培养的细菌那么的大。因此，我们假定至少一些种群的独特的浮力密度可以被测算出来，这些细胞就有 可能利用DDCS方法分离。 在这个研究中，我们首先浓缩一个天然细菌群体以收集足够数量的细胞。用DDCS方法把它们分成三部 分，每部分的群落结构由荧光原位杂交（FISH）区分。古生菌细胞趋向于出现在高浓度部分，反之那些噬 细胞菌属-产黄菌属-拟杆菌属在的浓度部分。据我们所知，这是关于自然海生细菌的浮力密度的第一篇报 告。 材料和方法
我们用已经消毒过的塑料桶在一个名为burat subo小港口（北纬350g.5,东经139°36.5”： Sagm■Bay,日本)的地方于2004年6月28日，2004年10月25日，2005年1月24日，2005年4月 18日分别取得4升表层海水，这些样品通过微孔聚碳酸酯过滤器（直径47毫米；孔直径3.0微米：型号℃ B111112:hatman,liddlese%,ited Kingdo)预过花。然后，这些经过预过滤的样品经过另一种微 孔聚城酸留过滤器（直径S0毫米：孔直径2.0微米：裂号代B111706:hatman)进行超滤，超滤装置 的型号为：(P90K:dvantec,.Toko,Japan》.超花的环境中充满了氯气，压力为1a,样品被浓缩至 原浓度的133~200倍。经过不到4个小时的上述过程之后，这些样晶被保存在零下4摄氏度的环境中。 从这些被浓缩的样品中取出一小都分分成三小份，这三小份按照以下的步骤核平行的处理：根据 Nishino等人的方法(13)，再经过一些小的政进，每小份样品通过0CS分.简单的说，我门使用了一 种名为Percol1(rshan B1 osciences,,Uppsala,瑞典)的梯度工作溶液，这种溶液含有61一-3%的 Percol,10%的倒NC1溶液，10%的10×磷酸盐援冲液(7.4)，以及17一19%的藤情水。然后我 们用一些很小的珠子来检测该溶液的密度梯度。接着我们取出3毫升这种工作溶液，将1毫升的我们的样 品置于该工f作溶液的表面，然后将这种混合液使用S40 Ti rotor(Bck面n,C》1 a Beckmn0 ptim XI.-90 centrifuge在50,512×g8d4摄氏度下超速离心29分钟。 经过超速离心后，通过使用P1ston梯度分馏器《B1oco取，Freder1ct0m,加拿大)这共样品被分成 上，中，下三层。含有我们所需要的微较的这三层样品的浮力密度相对值分别属于大于1.64，在1,06网 到1.074之间和大于1.04三个区间。每层分别用高压蒸汽灭茵过的，而且用0.2微米孔径的过滤器过滤 过的人造海水稀释，然后核终浓度为2%的多聚甲征固定。 在用DAP1(4',6-二践基-2-苯基同引噪)染色后，细照的数量通过受光暴微镜(H2:01ypus,Toky0 Ja即a)(15)计数出来。对于每个样品，至少20个菌落和大于400个细胞被计数出来。每个被分层的样 品核1 sopore聚碳酸酯过滤器（直径25毫米：孔径0.2微米：type GTTP02500:i11 ipore, Eschborn,Germany)过池，过滤条件为真空100aPa。这些过涉器和样品在过滤操作之前都置于零下20摄氏 度的环境中。我们还从QIE公司（日本，东京）购买了带有C3标签的寡枝苷酸片断。深针的名字，粑 点，核作酸序列列在了表1中。其中的加ET42 and GAM42探针是鼓作为竞争者的关系而使用的，每个过 花器被切成了8个片断，然后放置在我玻片上，并用封口膜erican National Can,Chicag,L)覆盖： 面且用含有29.微升桑交缓冲液（表2）和06微升的含有250的克每微升的上述寡核苷酸片断的探针的共 30微升的混合溶液覆盖。在4摄氏度的温箱中恒温培养了90分钟后，上述过滤器敲转入到一个含有48摄氏 度洗脱液的小瓶中，并在48摄氏度下培养15分钟。接着将这生过滤器取出。故置于To滤纸(dvantec》上 琼干，然后放置在封口膜上，并用50微升的如4PI溶液(1微克每毫升溶于燕喻水中，并用0.2微米的过滤器 过滤过)浸泡，注童这个过程是在室温和黑暗条件下进行的。然后这些过滋器被轻轻的用50毫升的0,2微米
我们用已经消毒过的塑料桶在一个名为 Aburatsubo 小港口 (北纬 35°09.5’, 东经 139°36.5’; Sagami Bay, 日本) 的地方于 2004 年 6 月 28 日，2004 年 10 月 25 日，2005 年 1 月 24 日，2005 年 4 月 18 日分别取得 4 升表层海水。这些样品通过微孔聚碳酸酯过滤器(直径 47 毫米; 孔直径 3.0 微米; 型号 PC MB 111112; Whatman, Middlesex, United Kingdom)预过滤。然后，这些经过预过滤的样品经过另一种微 孔聚碳酸酯过滤器(直径 90 毫米; 孔直径 2.0 微米; 型号 PC MB 111706; Whatman)进行超滤，超滤装置 的型号为：(UHP-90K;Advantec, Tokyo, Japan)。超滤的环境中充满了氮气，压力为 1MPa，样品被浓缩至 原浓度的 133～200 倍。经过不到 4 个小时的上述过程之后，这些样品被保存在零下 4 摄氏度的环境中。 从这些被浓缩的样品中取出一小部分分成三小份，这三小份按照以下的步骤被平行的处理：根据 Nishino 等人的方法（13），再经过一些小的改进，每小份样品通过 DDCS 分馏。简单的说，我们使用了一 种名为 Percoll (Amersham Biosciences, Uppsala, 瑞典) 的梯度工作溶液，这种溶液含有 61～63﹪的 Percoll，10﹪的 4M NaCl 溶液，10﹪的 10×磷酸盐缓冲液（pH 7.4），以及 17～19﹪的蒸馏水。然后我 们用一些很小的珠子来检测该溶液的密度梯度。接着我们取出９毫升这种工作溶液，将１毫升的我们的样 品置于该工作溶液的表面，然后将这种混合液使用SW40 Ti rotor (Beckman, CA) in a Beckman Optima XL-90 centrifuge 在 50,512 ×g and 4 摄氏度下超速离心 20 分钟。 经过超速离心后, 通过使用 Piston 梯度分馏器 (Biocomp, Fredericton, 加拿大)这些样品被分成 上，中，下三层。含有我们所需要的微粒的这三层样品的浮力密度相对值分别属于大于 1.064，在 1.064 到 1.074 之间和大于 1.074 三个区间。每层分别用高压蒸汽灭菌过的，而且用 0.2 微米孔径的过滤器过滤 过的人造海水稀释，然后被终浓度为 2％的多聚甲醛固定。 在用DAPI（4',6'-二脒基-2-苯基吲哚）染色后，细胞的数量通过荧光显微镜(BH-2; Olympus, Tokyo, Japan) (15)计数出来。对于每个样品,至少２０个菌落和大于４００个细胞被计数出来。每个被分层的样 品被Isopore 聚碳酸酯过滤器(直径25毫米; 孔径 0.2 微米; type GTTP 02500; Millipore, Eschborn,Germany) 过滤，过滤条件为真空100kPa。这些过滤器和样品在过滤操作之前都置于零下20摄氏 度的环境中。我们还从QIAGEN公司（日本，东京）购买了带有Cy3标签的寡核苷酸片断。探针的名字，靶 点，核苷酸序列列在了表１中。其中的BET42a and GAM42a探针是被作为竞争者的关系而使用的。每个过 滤器被切成了8个片断，然后放置在载玻片上，并用封口膜(American National Can, Chicago, IL)覆盖， 而且用含有29.4微升杂交缓冲液（表2）和0.6微升的含有250纳克每微升的上述寡核苷酸片断的探针的共 30微升的混合溶液覆盖。在46摄氏度的温箱中恒温培养了90分钟后，上述过滤器被转入到一个含有48摄氏 度洗脱液的小瓶中，并在48摄氏度下培养15分钟。接着将这些过滤器取出，放置于Toyo滤纸(Advantec)上 晾干，然后放置在封口膜上，并用50微升的DAPI溶液(1 微克每毫升溶于蒸馏水中，并用0.2微米的过滤器 过滤过)浸泡，注意这个过程是在室温和黑暗条件下进行的。然后这些过滤器被轻轻的用50毫升的0.2微米
过滤过的蒸馆水清洗，接着在Toyo滤纸上鲸干，在载玻片上用Citif1uorF1(Citif1 uor Ltd.,Canterbury, 英国)()制成标本装片，在条交之后，过滤器片新上的细菌可以通过羲光显微镜(2：01y国阳s)和Cy3 过滤器接收机计数出来。对于每个样品和探针，至少20菌落和多于00个细胞被数出来。所有的数量可以 通过减去阁38探针这一明性对1米校正。 实验结果 细胞浓缩：DP1一阳性细胞的细胞浓第效率（由浓绵前后海水中细胞个数的百分数比率表示）分布由 88%至98%（见表3）.若从不同的特定探针或染料效果米看浓缩效率则从6%(2004年10月25日，) 分布到100%(2005年1月24日G4WM42a)。(平均值91%，标准偏差9,2%，变异系数10%，样本总体 N一24，见表3)在浓缩过程中没有改变相关种群相对的数量关系。 DPI阳性细胞在每肥分的数量：每一样品根据浮力密度被分成上、中、下三部分：上(1.06R/C, 中1.064t至1,074。/c■，下>1,074/c。在实验中能被PI染色的细商被视为“总细面”。对 于四个样品，分管前的3部分的“总细衡”占总体的相%到71%（平均61%，标准偏差9.1%，变异系 数5%)。在现有条件下，我们还不能复原主要部分的细菌，也没有把注意力放在细菌形态大小的不同上， 各个部分在“总细商”所占的比例为：上26%-48%（平均40%，标准偏差9.5%，变异系数24%）， 中16%一54%（平均32%，标准偏差16%.变异系数50%），下20%一41%（平均29%，标准偏差9.2%， 变异系数31%)（见图1）·面变异系数在3个二次拍样样品中差异较小(0.4%~67%)。 每部分用转定探针获得的细《数：我们收集了四个不同季节的样品。与特定探针相匹配的细商占“总 细菌”的百分比收录于图1中。在所有的使用探针的样品中的变异系数为0.24一13%。我们发现在相关的 细菌种群中存在一种趋势：属于堂细围西属一产黄菌属一数杆商属的更集中于上层部分低浓度部分，而古生 菌细胞趋向于出现在下层部分即高浓度部分。 讨论 从天然春水中富集的的细胞用CS的方法被分成三部分，每部分的群落结构可通过荧光原位杂交 (F15用)来证实。古生鞠的细胞顿向于出现在高密度都分，CB细胞出观在低密度的部分。这个结果显示 一些分类学群体有着独特的浮力密度。 细胞富集：对于CS方法。一毫升样品加在工作溶流的项端，对于有着不同类探针的FIS,为了得 到足够数量的细围，服必要在实验步果前富集细胞。在预先的调查之后，我们决定得到一个密度大约为每 意升1心个细胞的悬浮液，这需要100200倍浓缩的天然海水样品。关于这种天然水生细菌富集的报告很 少。目前方法的富集效率大约为9八。这种效率适合于切向流系饶培养的埃希氏大畅杆菌。我门发现不月 的探针特异的组之间的富集效率差测很小，说明在富集过程中没有差测。在这项研究里。用心5分离样 本后再应用荧光源位杂交法，是因为在培养依规的技术中。这种方法能提供最可信的数据资料。如果有另
过滤过的蒸馏水清洗，接着在Toyo滤纸上晾干，在载玻片上用Citifluor AF1 (Citifluor Ltd., Canterbury, 英国) (4)制成标本装片。在杂交之后，过滤器片断上的细菌可以通过荧光显微镜(BH-2; Olympus)和Cy3 过滤器接收机计数出来。对于每个样品和探针，至少20菌落和多于400个细胞被数出来。所有的数量可以 通过减去NON338 探针这一阴性对照来校正。 实验结果 细胞浓缩:DAPI－阳性细胞的细胞浓缩效率（由浓缩前后海水中细胞个数的百分数比率表示）分布由 88％至 96％（见表 3）。若从不同的特定探针或染料效果来看浓缩效率则从 66％（2004 年 10 月 25 日， ） 分布到 100％（2005 年 1 月 24 日 GAM42a）。（平均值 91％，标准偏差 9.2％，变异系数 10％，样本总体 N＝24，见表 3）在浓缩过程中没有改变相关种群相对的数量关系。 DAPI 阳性细胞在每部分的数量:每一样品根据浮力密度被分成上、中、下三部分：上1.074 g/ cm3 。在实验中能被 DAPI 染色的细菌被视为“总细菌”。对 于四个样品，分馏前的 3 部分的“总细菌”占总体的 49％到 71％（平均 61％，标准偏差 9.1％，变异系 数 15％）。在现有条件下，我们还不能复原主要部分的细菌，也没有把注意力放在细菌形态大小的不同上。 各个部分在“总细菌”所占的比例为：上 26％～48％（平均 40％，标准偏差 9.5％，变异系数 24％）， 中 16％～54％（平均 32％，标准偏差 16％，变异系数 50％），下 20％～41％（平均 29％，标准偏差 9.2％， 变异系数 31％）（见图 1）。而变异系数在 3 个二次抽样样品中差异较小（0.4％～6.7％）。 每部分用特定探针获得的细胞数:我们收集了四个不同季节的样品，与特定探针相匹配的细菌占“总 细菌”的百分比收录于图 1 中。在所有的使用探针的样品中的变异系数为 0.24～13％。我们发现在相关的 细菌种群中存在一种趋势：属于噬细胞菌属-产黄菌属-拟杆菌属的更集中于上层部分低浓度部分，而古生 菌细胞趋向于出现在下层部分即高浓度部分。 讨论 从天然海水中富集的的细胞用 DDCS 的方法被分成三部分，每部分的群落结构可通过荧光原位杂交 （FISH）来证实。古生菌的细胞倾向于出现在高密度部分，CFB 细胞出现在低密度的部分。这个结果显示 一些分类学群体有着独特的浮力密度。 细胞富集：对于 DDCS 方法，一毫升样品加在工作溶液的顶端。对于有着不同类探针的 FISH，为了得 到足够数量的细胞，很必要在实验步骤前富集细胞。在预先的调查之后，我们决定得到一个密度大约为每 毫升 108 个细胞的悬浮液，这需要 100-200 倍浓缩的天然海水样品。关于这种天然水生细菌富集的报告很 少。目前方法的富集效率大约为 90%，这种效率适合于切向流系统培养的埃希氏大肠杆菌。我们发现不同 的探针特异的组之间的富集效率差别很小，说明在富集过程中没有差别。在这项研究里，用 DDCS 分离样 本后再应用荧光原位杂交法，是因为在培养依赖的技术中，这种方法能提供最可信的数据资料。如果有另
一种需要较少细围的方法被应用，细胞富集的程序被可以省去。 CS应用于自然海生细菌群落：在以前的研究中，C5被专门应用到在实验条件下培养的细南细围中。 依靠NT将CS应用于白然细菌群体是专门为了增加有控活生药的密度：因此不是依靠白然群落的浮力密 度的差别。当应用于白然的聚集体时，用S分离细胞应该仅仅依靠它们的浮力密度，面不是其他的因素 如饵胞大小和凝集。如果在目前的超建离心法的条件下，沉降平衡没有按建立，这些因素会明显影响结果， 假设细胞直径是0,3■■，浮力密度是1,087/c,在目前的超速离心状态下细雕会移动163。因为密度为 1.087g/c的浮力标记珠位于距测试管表面65m处，沉降平衡应该在超速离心式间段内建立。细胞的形状 也不会造成什么影响，因为轴比为20的长椭球在我们的超速离心状态下会移动82，因此，细胞大小，形 态和聚集状老等因素很难影响到当前的结果。显微观察也支持这个观点。 用当前的假设方法，61的海生细南聚集体恢复正常：到下的3%在处理后可能进入了细散复亡。为了 针对细胞的原的浮力密度分离它们，需要红S方法之后将细胞周定。一些血影细胞，如果存在的话。可 能无法承受应用P©©l1的超速离心，另一种可整性是我们的样本里有一些超重细菌。在超速离心后，浓 增的物质沉积在离心管的底部。因为我们无法从这些沉积物中重新获得活细胞，超重细菌存在的可能性还 有特考察。这些超重细菌可能与浓增的成分或金属有关。 海生古生面和真细菌的浮力酱度：应用心C5,我们发现属于第细胞菌属-产黄衡属-拟杆菌属(C用) 的白由生长细胞的浮力密度（分酸在顶密）比白由生长的古生两细围的浮力密度低（底部）。这个发观与 这些群落在自然海水中的分布相符。由于浮游植物，噬细胞菌属一产黄菌属一拟杆菌属B氧菌倾向于生活 在表面，而吉生南占暴了一半以上深海细商。尤其是在1000以下。虽然吉生南细围的细胞膜普希由阿克 醇和卡克醇组成，而真细菌的细胞膜由油脂构成，究竟事种细胞特征解释了浮力密度的不同还不清楚。因 此生物化学研究也许能解释影响浮力密度的因素。在这项研究中我们无法找到其它亲缘群体的浮力密度变 化趋势。可能是由于它们是具有生理差别的饵胞的混合体，也许是由于每一个群落都包含了具有广泛密度 特征的亚群组成。 细菌沉降速率计算：因为这个工作提供了第一于的海生细菌群落浮力密度的数据资料，我们同时用 S0ke定律估计了它们的沉降速率。对于海生细南和海水我们徽了如下覆设：细散是直径为0,3μ的球体： 低，中，高老度细菌的浮力密度分别是1.047,1.067,1.0s7,海水的密度是1.027g/c,这时的海水湿度 是5”C。在这个假设的基础上，低，中，高密度的闭菌的沉降速率分别是10,0和30■h,这些数值在 2C时增长1.5倍。 这个沉降速率很小，海生细菌实际上不能在用有与我们计算中的假设所不问的物理化学因素和密度的 水团域水流中移动。然而，大约100μ■的沉降速率说明细园能教重力作用影响。这正解释了它门的 垂直运动。近期研究结果暴示微尺度为(2,16,17,18)的细胞存在异向分布。依载于浮力密度的细菌
一种需要较少细胞的方法被应用，细胞富集的程序被可以省去。 DDCS应用于自然海生细菌群落：在以前的研究中，DDCS被专门应用到在实验条件下培养的细菌细胞中。 依靠INT将DDCS应用于自然细菌群体是专门为了增加有益活生菌的密度；因此不是依靠自然群落的浮力密 度的差别。当应用于自然的聚集体时，用DDCS分离细胞应该仅仅依靠它们的浮力密度，而不是其他的因素 如细胞大小和凝集。如果在目前的超速离心法的条件下，沉降平衡没有被建立，这些因素会明显影响结果。 假设细胞直径是0.3μm ,浮力密度是1.087g/ cm3 ,在目前的超速离心状态下细胞会移动163mm。因为密度为 1.087g /cm 3的浮力标记珠位于距测试管表面65mm处，沉降平衡应该在超速离心式间段内建立。细胞的形状 也不会造成什么影响，因为轴比为20的长椭球在我们的超速离心状态下会移动82mm。因此，细胞大小，形 态和聚集状态等因素很难影响到当前的结果。显微观察也支持这个观点。 用当前的假设方法，61%的海生细菌聚集体恢复正常；剩下的30%在处理后可能进入了细胞衰亡。为了 针对细胞的原始浮力密度分离它们，需要在DDCS方法之后将细胞固定。一些血影细胞，如果存在的话，可 能无法承受应用Percoll的超速离心。另一种可能性是我们的样本里有一些超重细菌。在超速离心后，浓 缩的物质沉积在离心管的底部。因为我们无法从这些沉积物中重新获得活细胞，超重细菌存在的可能性还 有待考察。这些超重细菌可能与浓缩的成分或金属有关。 海生古生菌和真细菌的浮力密度：应用DDCS，我们发现属于噬细胞菌属-产黄菌属-拟杆菌属（CFB） 的自由生长细胞的浮力密度（分散在顶部）比自由生长的古生菌细胞的浮力密度低（底部）。这个发现与 这些群落在自然海水中的分布相符。由于浮游植物，噬细胞菌属-产黄菌属-拟杆菌属CFB细菌倾向于生活 在表面，而古生菌占据了一半以上深海细菌，尤其是在1000m以下。虽然古生菌细胞的细胞膜普遍由阿克 醇和卡克醇组成，而真细菌的细胞膜由油脂构成，究竟哪种细胞特征解释了浮力密度的不同还不清楚。因 此生物化学研究也许能解释影响浮力密度的因素。在这项研究中我们无法找到其它亲缘群体的浮力密度变 化趋势，可能是由于它们是具有生理差别的细胞的混合体，也许是由于每一个群落都包含了具有广泛密度 特征的亚群组成。 细菌沉降速率计算：因为这个工作提供了第一手的海生细菌群落浮力密度的数据资料，我们同时用 Stoke定律估计了它们的沉降速率。对于海生细菌和海水我们做了如下假设：细胞是直径为0.3 μm的球体； 低，中，高密度细菌的浮力密度分别是1.047，1.067，1.087，海水的密度是1.027 g/cm3 ,这时的海水温度 是5°C。在这个假设的基础上，低，中，高密度的细菌的沉降速率分别是10，20和30μm h-1 ,这些数值在 200 C时增长1.5倍。 这个沉降速率很小，海生细菌实际上不能在拥有与我们计算中的假设所不同的物理化学因素和密度的 水团或水流中移动。然而，大约10-30μm h-1的沉降速率说明细胞能被重力作用影响，这正解释了它们的 垂直运动。近期研究结果显示微尺度为（2，16，17，18）的细胞存在异向分布。依赖于浮力密度的细菌
沉降速率可俺导政了这种分布机制月时给了这种异面化新的解释。这种程度的细酋多样性，比如微区或者 热点，将导致生物化学地跟循环。因此，海生细商的浮力密度对于研究这类分布很重要。 最后，S被应用到了自然海生细菌聚集体中，用荧光原位条交研究了每一部分的群落结构。CB细 商趋向于低密度，而古生菌趋向于高密度。用St0ke定律计算的沉降速率大概是10-0μ■h。据我们所知。 这是第一份建立在浮力密度基留上的海生细菌分离的报告。我们最近正在研究浮力密度和白然海水中细菌 功能的关系。 致谢 我们对伊东isaki海洋生物中心和东京大学在取样时的支持表示感谢。我们同时感谢小川宏liroshi Ogaa在细菌富集技术上的出色的技术建议和野村黄明的评价和讨论。 这项工f作是由The Japan Science Society的世川Sasakawa Scientific Research Grant和由te Ministry of Education,Science,Sports and Culture of Japan Research Project Grant-in-Aid for Scientific Research共间支杆的
沉降速率可能导致了这种分布机制同时给了这种异质化新的解释。这种程度的细菌多样性，比如微区或者 热点，将导致生物化学地球循环。因此，海生细菌的浮力密度对于研究这类分布很重要。 最后，DDCS被应用到了自然海生细菌聚集体中，用荧光原位杂交研究了每一部分的群落结构。CFB细 菌趋向于低密度，而古生菌趋向于高密度。用Stoke定律计算的沉降速率大概是10-30μm h-1。据我们所知， 这是第一份建立在浮力密度基础上的海生细菌分离的报告。我们最近正在研究浮力密度和自然海水中细菌 功能的关系。 致谢 我们对伊东Misaki海洋生物中心和东京大学在取样时的支持表示感谢。我们同时感谢小川宏Hiroshi Ogawa在细菌富集技术上的出色的技术建议和野村英明的评价和讨论。 这项工作是由The Japan Science Society 的世川Sasakawa Scientific Research Grant 和由the Ministry of Education, Science, Sports and Culture of Japan 资助的Research Project Grant-in-Aid for Scientific Research 共同支持的