低葡萄糖连续培养的酿酒酵母过量生产苏氨酸整缩酶会抑制丙酮酸脱氢酶的生物合成作用 酿酒酵母(S.cerevisiae)丙酮酸脱羧酶缺陷(Pdc)突变体需要少量乙醇或醋酸盐才能维 持需氧的、低葡萄糖生长。这种营养需求是由于1脂质和赖氨酸的生物合成需要胞浆乙酰-C4,11 不能将线粒体基质中的乙酰-CoA转移到细胞质中。为了验证这种假设说并消除PdcS.cerevisiae 对C,的需求，我们尝试采用一种胞浆乙酰-Co4合成的替代途径。将L一肉毒碱加入培养基中并不能 恢复Pdc在葡萄糖上的生长，这表明酿酒酵母对C:的需求不仅仅是因为它不能合成这种化合物。 酿酒酵母GL7基因编码苏氨酸醛缩酶(C4.1.2.5),这种酶催化苏氨酸裂解为甘氨酸和乙醛。GL7 基因的过表达能使Pc菌株在碳限制连续培养中以葡萄糖为唯一碳源生长，这表明由苏氨酸醛缩酶 产生的乙醛可作为胞浆乙酰-CA合成的前体。分馏法研究发现了苏氨酸醛缩酶在胞浆中的定位。培 养过程中甘氨酸的缺乏表明苏氨酸醛缩酶生产的所有甘氨酸都被同化或异化了。这些实验结果证实 了丙酮酸脱羧酶参与了胞浆乙酰-CoA的合成。在分批培养中Pde-GL1基因过表达菌株仍然对葡萄 糖敏感。就像其他P©菌株一样，此菌株在过量葡萄糖分批培养中不能生长，并且将其从葡萄糖限 制培养基转移到葡萄糖过量培养基时会分泌出丙酮酸。 丙酮酸脱氢酶(PDC)由PD☑，PD5和PD5编码，用于它催化酵母酒精发酵中的第一步且是 不可逆的反应，所以它一直被认为是一个严格的异化酶。与这个看法一致的是，在葡萄糖复合培养 基分批培养中，酿酒酵母PDC缺失突变体比生长率急剧降低，而葡萄糖代谢野生型酿酒酵母可以很 好地发酵[35]。 在低残留葡萄糖浓度的需氧低葡萄糖连续培养中，葡萄糖对呼吸酶的抑制作用降低了[4,37]。 在这种培养中比生长速率较低，野生型细胞仅通过呼吸作用来异化葡萄糖[4,37]。尽管如此，在 这种条件下，酿酒酵母Pc菌株不能以葡萄糖为唯一碳源生长，但往培养基中加入少量乙醇和醋酸 盐后可以恢复其生长[10,12]。酿酒酵母Pdc菌株这种对C,化合物的需求反映出了PDC在胞浆乙 酰-CoA的合成中起到非常重要的作用，而脂质和赖氨酸的合成需要胞浆乙酰-CoA[10]。P0C催化将 丙氨酸转化为胞浆乙酰-CoA的第一步反应，这步反应中还需要乙醛脱氢酶和乙酰-CoA合成酶[17， 31,32]。与所设想的这个PDC的生物合成作用相一致的是，实验证实Pdc突变体对C,化复合物需 求的最小值符合胞浆乙酰-CoA的理论需求量[10]。 在一定程度上来说PDC在胞浆乙酰-CoA生物合成中的重要作用是令人惊讶的，因为已经知道有 几种缺乏PDC的酵母菌在葡萄糖上能迅速生长。例如，Pdc菌株Kluyveromyces lactis在以葡萄 糖为唯一碳源时生长迅速[2,14】。此外，缺乏PDC的脂质积累酵母arrowia lipolytica,可利用 ATP柠檬酸裂解酶将乙酰-CoA从线粒体基质运输到细胞质中，在线粒体基质中乙酰-CoA由丙酮酸脱
低葡萄糖连续培养的酿酒酵母过量生产苏氨酸醛缩酶会抑制丙酮酸脱氢酶的生物合成作用 酿酒酵母（S. cerevisiae）丙酮酸脱羧酶缺陷（Pdc—）突变体需要少量乙醇或醋酸盐才能维 持需氧的、低葡萄糖生长。这种营养需求是由于 i 脂质和赖氨酸的生物合成需要胞浆乙酰-CoA，ii 不能将线粒体基质中的乙酰-CoA 转移到细胞质中。为了验证这种假设说并消除 Pdc— S. cerevisiae 对 C2 的需求，我们尝试采用一种胞浆乙酰-CoA 合成的替代途径。将 L-肉毒碱加入培养基中并不能 恢复 Pdc—在葡萄糖上的生长，这表明酿酒酵母对 C2 的需求不仅仅是因为它不能合成这种化合物。 酿酒酵母 GLY1 基因编码苏氨酸醛缩酶（EC4.1.2.5），这种酶催化苏氨酸裂解为甘氨酸和乙醛。GLY1 基因的过表达能使 Pdc—菌株在碳限制连续培养中以葡萄糖为唯一碳源生长，这表明由苏氨酸醛缩酶 产生的乙醛可作为胞浆乙酰-CoA 合成的前体。分馏法研究发现了苏氨酸醛缩酶在胞浆中的定位。培 养过程中甘氨酸的缺乏表明苏氨酸醛缩酶生产的所有甘氨酸都被同化或异化了。这些实验结果证实 了丙酮酸脱羧酶参与了胞浆乙酰-CoA 的合成。在分批培养中 Pdc— GLY1 基因过表达菌株仍然对葡萄 糖敏感。就像其他 Pdc—菌株一样，此菌株在过量葡萄糖分批培养中不能生长，并且将其从葡萄糖限 制培养基转移到葡萄糖过量培养基时会分泌出丙酮酸。 丙酮酸脱氢酶（PDC）由 PDC1，PDC5 和 PDC6 编码，用于它催化酵母酒精发酵中的第一步且是 不可逆的反应，所以它一直被认为是一个严格的异化酶。与这个看法一致的是，在葡萄糖复合培养 基分批培养中，酿酒酵母 PDC 缺失突变体比生长率急剧降低，而葡萄糖代谢野生型酿酒酵母可以很 好地发酵[35]。 在低残留葡萄糖浓度的需氧低葡萄糖连续培养中，葡萄糖对呼吸酶的抑制作用降低了[4，37]。 在这种培养中比生长速率较低，野生型细胞仅通过呼吸作用来异化葡萄糖[4，37]。尽管如此，在 这种条件下，酿酒酵母 Pdc—菌株不能以葡萄糖为唯一碳源生长，但往培养基中加入少量乙醇和醋酸 盐后可以恢复其生长[10，12]。酿酒酵母 Pdc—菌株这种对 C2 化合物的需求反映出了 PDC 在胞浆乙 酰-CoA 的合成中起到非常重要的作用,而脂质和赖氨酸的合成需要胞浆乙酰-CoA[10]。PDC 催化将 丙氨酸转化为胞浆乙酰-CoA 的第一步反应，这步反应中还需要乙醛脱氢酶和乙酰-CoA 合成酶[17， 31，32]。与所设想的这个 PDC 的生物合成作用相一致的是，实验证实 Pdc—突变体对 C2 化复合物需 求的最小值符合胞浆乙酰-CoA 的理论需求量[10]。 在一定程度上来说 PDC 在胞浆乙酰-CoA 生物合成中的重要作用是令人惊讶的，因为已经知道有 几种缺乏 PDC 的酵母菌在葡萄糖上能迅速生长。例如，Pdc—菌株 Kluyveromyces lactis 在以葡萄 糖为唯一碳源时生长迅速[2，14]。此外，缺乏 PDC 的脂质积累酵母 Yarrowia lipolytica，可利用 ATP 柠檬酸裂解酶将乙酰-CoA 从线粒体基质运输到细胞质中，在线粒体基质中乙酰-CoA 由丙酮酸脱
氢酶复合物反应得到[8]，ATP柠檬酸裂解酶并不存在于根酒酵母中，所以排除了这种酶参与鞋浆乙 脱C4合成过程的可能[33】. 通常认为在包括酸酒醇母的真核细型中[19,31】，肉毒碱穿梭载体在乙酰C0A通过线粒体内 膜的转运过程中起到根大的作用。尽管酿清酵母含有编码肉毒碱转移酶和乙酰一肉毒碱移位酶的速 传信息[1,7,27,38,39]，但近米却发现假消酵母并不能合成L-肉毒碱[39]。由于并没有研究表 明L-肉毒碱是否逢够使酿酒酵母P商株在葡萄糖上生长，所以现在仍然不清楚肉毒碱穿梭载体 能否催化乙酰CA从线粒体基质的输出。 酿消解母P菌株对C的需求营养要求并不仅仅具有重要的科学价值，P菌株的酒精发得 作用的缺乏可能在生物质定向应用方面很有价植，这种商株另一个己经敲证明了的应用就是采用乳 酸酸氯酶将糖分解所得的NH用于具有商业价值的乳酸的合成[9]。在所有这些应用中，消除对 C2化合物的需求将会减轻工艺流程设计的困难。 本次研究是为了检验C对于生长在葡商糖上的酸酒酵母中胞浆乙酰CM的合成是香必不可 少，研究肉毒碱穿梭截体在将乙酰C0A从线粒体基质运出过程中可能起到的作用，并通过代谢工程 消除酿酒醇母Pc菌株对C的需求。下一步的研究目标是在P菌株中过量表达风门基因，这个 基因编码能够催化苏氨酸降解成甘氨酸和乙征的苏氨酸整缩酶[21,25】。 表1用于本次研究的酸酒酵母药株 百株 基因型 CX,Pw182......ATa pde1(-6,-2):loxP pd5(-6-2)::loxP pde6(-6,-2:10xP CX.PK111-61A.,,1T-8ra3-521eu2-112h1s3-△1 B882..MATa pde1(-6,-2):lopd5(-6,-2》:loxP pdc6(6,-2: 1oxP1eu2-l12his3-△1 B893....MATapde1(-6,-2:1opdc5(-6,-2》:1oxP pdc6(-6,-2)::loxP leu2-112 his3::pYX022-Aat 材料与方法 菌株和保囊。本次研究所使用和构建的能酒酵母鞠株（如表1）是C风K家族的同类成员 (38),原种培养是在30℃的摇瓶中，其中为100毫升含有20g/L葡萄糖的合成培养基，到达 稳定期后加入20%(VN)甘油，取2毫升存放在-80℃保存。 质粒的构蓬，在表达载体E即lac181上将GY门1基因克降到TPI1启动子之后(15)·根据 酸酒醇母5(34)的染色体风进行⑧扩增得到GYI基因，CR时的寡核苷酸引物为： 5-GGAATTCTAGAATGACTGAGTTCGAATTGCCTCCAAAATATAC-3
氢酶复合物反应得到[8]。ATP 柠檬酸裂解酶并不存在于酿酒酵母中，所以排除了这种酶参与胞浆乙 酰-CoA 合成过程的可能[33]。 通常认为在包括酿酒酵母的真核细胞中 [19，31]，肉毒碱穿梭载体在乙酰-CoA 通过线粒体内 膜的转运过程中起到很大的作用。尽管酿酒酵母含有编码肉毒碱转移酶和乙酰-肉毒碱移位酶的遗 传信息[1，7，27，36，39]，但近来却发现酿酒酵母并不能合成 L-肉毒碱[39]。由于并没有研究表 明 L-肉毒碱是否能够使酿酒酵母 Pdc—菌株在葡萄糖上生长，所以现在仍然不清楚肉毒碱穿梭载体 能否催化乙酰-CoA 从线粒体基质的输出。 酿酒酵母 Pdc—菌株对 C2 的需求营养要求并不仅仅具有重要的科学价值，Pdc—菌株的酒精发酵 作用的缺乏可能在生物质定向应用方面很有价值。这种菌株另一个已经被证明了的应用就是采用乳 酸脱氢酶将糖分解所得的 NADH 用于具有商业价值的乳酸的合成[29]。在所有这些应用中，消除对 C2 化合物的需求将会减轻工艺流程设计的困难。 本次研究是为了检验 PDC 对于生长在葡萄糖上的酿酒酵母中胞浆乙酰-CoA 的合成是否必不可 少，研究肉毒碱穿梭载体在将乙酰-CoA 从线粒体基质运出过程中可能起到的作用，并通过代谢工程 消除酿酒酵母 Pdc—菌株对 C2 的需求。下一步的研究目标是在 Pdc—菌株中过量表达 GLY1 基因，这个 基因编码能够催化苏氨酸降解成甘氨酸和乙醛的苏氨酸醛缩酶[21，25]。 表 1 用于本次研究的酿酒酵母菌株 菌株 基因型 CEN.PK182 ..............MATa pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2):: loxP CEN.PK111-61A......MAT-a ura3-52 leu2-112 his3-△1 RWB882....................MATa pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2):: loxP leu2-112 his3-△1 RWB893....................MATapdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP leu2-112 his3::pYX022-Aat 材料与方法 菌株和保藏。本次研究所使用和构建的酿酒酵母菌株（如表 1 ）是 CEN.PK 家族的同类成员 （ 38 ） 。原种培养是在 30℃的摇瓶中，其中为 100 毫升含有 20g/L 葡萄糖的合成培养基 。到达 稳定期后加入 20 ％ （V/V）甘油,取 2 毫升存放在-80℃保存。 质粒的构建。 在表达载体 YEplac181 上将 GLY1 基因克隆到 TPI1 启动子之后（ 15 ） 。根据 酿酒酵母 M5（34 ）的染色体 DNA 进行 PCR 扩增得到 GLY1 基因，PCR 时的寡核苷酸引物为： 5-GGAATTCTAGAATGACTGAGTTCGAATTGCCTCCAAAATATAC-3
S-CCGCTOGAGACATGATGCAACTGGAACGC-3 PC混合物经晾脂糖凝胶电泳后，目的片段分离，用Ec成1和Xl酶切。酶切后的片段连接到 也用EcoRI和hoI酶切过的P02-atI1质较上.pYXO2-AatII质粒来自PYXOd2(以D系 统，明尼同被利斯，明尼苏达州)，将p门O2用AatI1酶切，插入其他4个限制南的南切位点：0l, BaH,Saal,el,并破环了AatII的酶切位点。重组质粒pkGL门再用el和Sacl酶切， 将获得的目的片段连入已用XbaI和SacI酶切过的YEplacl8I载体，得到重组质粒YEpY门， 菌株构建，882米自CX.PK182和CEK孩111-61A的杂交（由P.Ko”ttT提供，法兰 克幅，德国)。由此产生的二倍体雅子于6℃加热15分钟后，在以Q,2%醋酸销作为碳酒的YP 培养基上培养。再用葡萄糖检验所得菌落。R检测不能在葡萄糖上生长的菌落，看其C6基因是 否按破坏。然后在合成培养基中透择所需的亮氢酸营养缺陪型就是882。为了消除组氨酸营养 缺陷型。先转化YX022得到WB882,此南株转入质粒EGL门和YElc181(15)后得到GLY1- 过表达菌株893（正pGY门1）和相应的空载体菌株E893(YEplac181). 聚合酶链式反应。根据说明书，CR使用Ynt风聚合南（新英格兰生物实险室），PCR反应 进行的情况如下：94℃变性1分钟，然后65℃退火1分种，然后75℃延仲3.5分钟，共30个周 期。 箸养基。根据Yrd山m等人的研究成果，连续培养所用的合成培养基成分为：每公升款化水含 5g0M)S0.3gFP0,Q5gS0.7H20,0.05a1硅防沫剂，以及微量元素〔41).培养 基在120℃高温灭菌20分钟后，加入Yer山ym等人所述的过滤障茵的排生素溶液(41)，储存培 养基中碳源浓度总是250。碳源是葡司糖(675g/L)和留酸盐(Q.75gL)的混合物或单独的 葡萄糖(T,5g/八)，110℃高温灭茵后葡萄糖单独加入。未预先灭菌的纯替酸加入到高压蒸汽灭茵的 培养基中，分批培养和预培养的合成培养基含有1,5%的乙醇作为唯一碳薄，其他成分同连续培养 基。培养基中还要补充L-肉毒碱。其最终浓度为Q4/儿。 连续培养。需氧连续培养盟度为30℃，工作体积为1升，在2升发酵罐中进行（却plik, 斯希丹，背兰)。通过自动加入W氢氧化钾将出值控制在50。整个连线培养过程中为保特溶氧浓 度高于60%的空气饱和度。授并速度为800m,气流为Q5升每分钟，培养基各成分的加入由蠕 动泵控制。电传感器控制工作体积保持不变。至少在5倍体积的变化后培养基应仍处于稳定状态， 每个体积变化后培养基的干重，葡萄糖浓度，二氧化碳产半和氧的消耗半变化应小于2%。持续据 药过程中的溶氧浓度没有研究。培养物样品和流出物的生物量无显着性差异（小于1⅓）。 德萄糖愁冲实验。葡萄糖脉冲实验是向稳定状态的葡萄糖有限的连线培养过程中加入葡萄糖， 实验开始前铺动系关闭。为了实现50山葡萄糖脉冲，将18毫升的50%(t/o1)葡萄糖溶液通过
5-CCGCTCGAGACATGATGCAACTGGAACGC-3 PCR 混合物经琼脂糖凝胶电泳后，目的片段分离，用 EcoRI 和 XhoI 酶切。酶切后的片段连接到 也用 EcoRI 和 XhoI 酶切过的 pYX042 - AatII 质粒上。pYX042 - AatII 质粒来自 pYX042 （R&D 系 统，明尼阿波利斯，明尼苏达州），将 pYX042 用 AatII 酶切，插入其他 4 个限制酶的酶切位点：XhoI ， BamHI ， SmaI ，NheI，并破坏了 AatII 的酶切位点。重组质粒 pRWGLY1 再用 NheI 和 SacI 酶切， 将获得的目的片段连入已用 XbaI 和 SacI 酶切过的 YEplac181 载体，得到重组质粒 YEpGLY1 。 菌株构建。 RWB882 来自 CEN.PK182 和 CEN.PK111 - 61A 的杂交（由 P. Ko¨tter 提供，法兰 克福，德国）。由此产生的二倍体孢子于 56 ℃加热 15 分钟后，在以 0.2 ％醋酸钠作为碳源的 YP 培养基上培养。再用葡萄糖检验所得菌落。PCR 检测不能在葡萄糖上生长的菌落，看其 PDC6 基因是 否被破坏。然后在合成培养基中选择所需的亮氨酸营养缺陷型就是 RWB882 。为了消除组氨酸营养 缺陷型，先转化 pYX022 得到 RWB882。此菌株转入质粒 YEpGLY1 和 YEplac181 （ 15 ）后得到 GLY1- 过表达菌株 RWB893 （ YEpGLY1 ）和相应的空载体菌株 RWB893 （ YEplac181 ）。 聚合酶链式反应。根据说明书，PCR 使用 Vent DNA 聚合酶（新英格兰生物实验室）。PCR 反应 进行的情况如下：94 ℃变性 1 分钟，然后 65 ℃退火 1 分钟，然后 75℃延伸 3.5 分钟，共 30 个周 期。 培养基。根据 Verduyn 等人的研究成果，连续培养所用的合成培养基成分为：每公升软化水含 5g (NH4) 2SO4, 3g KH2PO4, 0.5g MgSO4.7H2O，0.05ml 硅防沫剂，以及微量元素（ 41 ）。培养 基在 120 ℃高温灭菌 20 分钟后，加入 Verduyn 等人所述的过滤除菌的维生素溶液（ 41 ）。储存培 养基中碳源浓度总是 250mM。碳源是葡萄糖（6.75 g/L）和醋酸盐（ 0.75g/L）的混合物或单独的 葡萄糖（7.5g/L）。110℃高温灭菌后葡萄糖单独加入。未预先灭菌的纯醋酸加入到高压蒸汽灭菌的 培养基中。分批培养和预培养的合成培养基含有 1.5 ％的乙醇作为唯一碳源，其他成分同连续培养 基。培养基中还要补充 L -肉毒碱，其最终浓度为 0.4g/L。 连续培养。需氧连续培养温度为 30℃，工作体积为 1 升，在 2 升发酵罐中进行（ Applikon ， 斯希丹，荷兰）。通过自动加入 2M 氢氧化钾将 pH 值控制在 5.0。整个连续培养过程中为保持溶氧浓 度高于 60 ％的空气饱和度，搅拌速度为 800rpm，气流为 0.5 升每分钟。培养基各成分的加入由蠕 动泵控制。电传感器控制工作体积保持不变。至少在 5 倍体积的变化后培养基应仍处于稳定状态， 每个体积变化后培养基的干重，葡萄糖浓度，二氧化碳产率和氧的消耗率变化应小于 2 ％。持续振 荡过程中的溶氧浓度没有研究。培养物样品和流出物的生物量无显着性差异（ 小于 1 ％ ）。 葡萄糖脉冲实验。葡萄糖脉冲实验是向稳定状态的葡萄糖有限的连续培养过程中加入葡萄糖。 实验开始前蠕动泵关闭。为了实现 50mM 葡萄糖脉冲，将 18 毫升的 50 ％(wt/vol)葡萄糖溶液通过
橡胶隔垫无商注入，在葡萄糖消耗和随后的代谢物消耗过程中，每隔适当时间测定培养物样品在0 睡的光密度和葡商糖及上清代谢物的浓度。 培养物干重测定。为了确定生物量干重，将己知体积的培养物（干重0,01-Q03克）用预干提 的己知重量的硝酸纤维素过滤器过滤。该过滤器用0毫升软化水冲洗并在30微波炉中千燥0 分钟，测量过滤落的重量增加。重复至变化小于1%， 代海产物分析。上清中的酚酿，葡萄糖。甘油和丙酮酸的浓度用高效液相色请法测定分析，用 Bi0一Rad的阴离子交换柱HPX-87千60°C测定。该柱用5硫酸洗脱，流速为0.6毫升每分钟. 内制酸和M酸用aters2487双波长吸光度探测器在214面测定。葡萄糖和甘油用aters2410 折射率深测器测定，葡萄糖的浓度用商业罗氏诊新试剂盒（编号71251）确定。 气体分析，用0 senount N灯A2000分析器分析氧气和二氧化碳的浓度前，连续培养的废气经 冷却和Permspure干燥机干燥。气体流量用离子科学数字流量计测量。具体氧气消耗量和二氧化碳 产量的计算使用a通k等人的方法(0)。 等活性测定。细围提取物的南活性的测定准备如知前所述《6)。亚细围成分的分离使用L知ttk 等人的方法。(23)。细胞色素C氧化酶(C1.9.3.1:Dou面等。[5])和葡萄糖六南酸脱氢酶 (C1.1.1,49:Postns等。【30])，作为标记酶用于定位研究，于30℃用日立ode1100-60 分光光度计根暴先前公布的方法进行测定。用F1k心ert等人所述的方法测定C(12):检测苏 氨酸缩酶的混合物为含a,1 MHEPES buffer(H7,0),Q,05M5-膝酸t哆盛。88/L乙醇脱 氢酶(EC1.1.1.1)和0.15W还冢型辅酶1的软化水.加入10W苏氨酸后反应开始.用日立100-60 分光光度计测定其在340m的吸光度来测定还原型辅酶1的氧化。以牛血清白蛋白作为标准，用 L0了法估计细胞提取物的蛋白浓度(2). 目收的酶活力 微校部分 可溶部分 苏氨酸盈增酶 1 94 灌萄糖6磷股税氢幕 1 101 细胞色素c氧化鬓 98 12 表2从需氧的葡萄糖限制的连线培养中获得的位过表达Pˉ南株E9g(ELY1)的组 织匀浆微校和可溶部分的苏氨酸橙缩酶和标志酶的回收 ·呈现的数据米自一个单独的有代表性的实险，复制实验得到类似的结果
橡胶隔垫无菌注入。在葡萄糖消耗和随后的代谢物消耗过程中，每隔适当时间测定培养物样品在 660 nm 的光密度和葡萄糖及上清代谢物的浓度。 培养物干重测定。为了确定生物量干重，将已知体积的培养物（干重 0.01-0.03 克）用预干燥 的已知重量的硝酸纤维素过滤器过滤 。该过滤器用 20 毫升软化水冲洗并在 360W 微波炉中干燥 20 分钟，测量过滤器的重量增加。重复至变化小于 1 ％ 。 代谢产物分析。上清中的醋酸，葡萄糖，甘油和丙酮酸的浓度用高效液相色谱法测定分析，用 Bio-Rad 的阴离子交换柱 HPX-87H 于 60°C 测定。该柱用 5mM 硫酸洗脱，流速为 0.6 毫升每分钟。 丙酮酸和醋酸用 Waters 2487 双波长吸光度探测器在 214 nm 测定。葡萄糖和甘油用 Waters 2410 折射率探测器测定。葡萄糖的浓度用商业罗氏诊断试剂盒（编号 716251）确定 。 气体分析。用 Rosemount NGA 2000 分析器分析氧气和二氧化碳的浓度前，连续培养的废气经 冷却和 Permapure 干燥机干燥。气体流量用离子科学数字流量计测量。具体氧气消耗量和二氧化碳 产量的计算使用 van Urk 等人的方法（ 40 ） 。 酶活性测定。细胞提取物的酶活性的测定准备如前所述（ 6 ）。亚细胞成分的分离使用 Luttik 等人的方法。（ 23 ）。细胞色素 C 氧化酶（EC1.9.3.1 ;Douma 等。[ 5 ]）和葡萄糖六磷酸脱氢酶 （EC1.1.1.49;Postma 等。[ 30 ]） ，作为标记酶用于定位研究，于 30 ℃用日立 model 100-60 分光光度计根据先前公布的方法进行测定。用 Flikweert 等人所述的方法测定 PDC（ 12 ）。检测苏 氨酸醛缩酶的混合物为含 0.1mM HEPES buffer (pH 7.0)，0.05mM 5-磷酸吡哆醛， 88U/mL 乙醇脱 氢酶（EC1.1.1.1）和 0.15mM 还原型辅酶 I 的软化水。加入 10 mM 苏氨酸后反应开始。用日立 100-60 分光光度计测定其在 340 nm 的吸光度来测定还原型辅酶 I 的氧化。以牛血清白蛋白作为标准，用 Lowry 法估计细胞提取物的蛋白浓度（ 22 ）。 酶 %回收的酶活力 微粒部分 可溶部分 苏氨酸醛缩酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 细胞色素 c 氧化酶 1 1 98 94 101 12 表 2 从需氧的葡萄糖限制的连续培养中获得的 GLY1-过表达 Pdc— 菌株 RWB893（YEpGLY1）的组 织匀浆微粒和可溶部分的苏氨酸醛缩酶和标志酶的回收 a a 呈现的数据来自一个单独的有代表性的实验。复制实验得到类似的结果
结果 L一肉毒碱带如到P酿横酵母连续培养中。最近表明酸酒醇母不能合成L-肉毒碱(39)。如果 肉毒碱营养缺陷型是P假酒酵母需要C,化合物的即因，需氧生长，低葡萄糖的连铁培养应该可 以改为添加1，-肉毒碱，为了研究这一可能性，做对凰粗连续培养，Pc菌株Rs9g(YEplac181) 以添加了Qg/L肉毒碱的葡萄糖和解酸盐作为碳源。培养基中添加L一肉毒碱和不添如相比，不影 响单位体积内黄体的碳产量(14.1/ol),也不影南葡商糖(1.07o1//h).餐酸盐(0.4mol/风/h), 0(2.95mol/g/h).或00(3.000l/e/h)的流量（表3）.当达到稳定状右后，培养基会技换成 以葡萄糖为唯一碳源但仍包含L-肉毒碱的培养基。在这个培养基中，自株从连续培养中洗脱。 显然，添加1-肉毒碱不能援教以葡萄糖为唑一碳源的连续培养中的P©酿酒酵母， Pˉ酿酒酵母中苏氨酸醛缩酵过量生产。除了5，酿酒酵母的新陈代谢网至少包含一种可选 择的反应能提供细胞溶质的C化合物。苏氨酸醛缩解(E配4.215)，位7基因编码的合成氨基乙 酸的关健酶，催化苏氨酸分解为氢基乙酸和乙醛(21,25)，为研究苏氢酸醛缩酶是香会取代印C 在其生物合成中的角色，我们尝试在I△d5AP6A南株中过表达C化合物C,化合物位， 为判定引入位？的表达茵是否会导致苏氨酸督缩酶的高活力，南话力在细胞液中测量。携带 风？表达商的Pk菌株的苏氨酸径缩酶活力是0.5土0.O1Dg/蛋白。然而相应空载体商株的话 力低于最低检出量0,006Ug/蛋白。 为研究过量生产的G1y印的亚细验定位，亦氨酸醛缩酶活力从低葡葡糖的连续培养中获得的细 園匀浆中的可溶部分和微粒部分决定。细胞溶质酶葡萄糖6一磷酸反氢在匀浆中的可溶部分全部 回收，线粒体标志酶，细散色素氧化酶的话力基本上专门位于特殊部分。过量生产百株中苏氢酸 醛缩刚活力基本上专门发现于细胞匀浆的可溶部分（表2），说明了G1y1p的细胞溶质定位。 位7过表达消除k酿酒醇母对C化合物的需求，在低葡面能连续培养中，Pˉ酿酒酵母的 生长香要添加少量乙醇或留酸盐于葡萄糖培养基中(10).像其它加突变一样，Glylp一过生产P水 菌株不能生长于添加葡萄糖的分批培养中。即使存在少量乙醇成醋酸盐（数基为给出）也不能生 长.因此，为验证G1y1p过生产回株和空载体对無菌株生长能力，把以箱萄糟为难一藏源，以0.10/h 稀释率生长的需氧混合培养基换成以葡萄糖为唯一碳源的培养基 正如所料。两种菌株都能在混合了葡萄糖和解酸盐的连续培养中生长（表3），在这种条件下， 培养物的关键生理学参数，如单位体积茵体的产量和呼吸商(Q)。对这两种商株而言没有明显的 不同（表3）。培养基中单位体积生物碳和二氧化碳的完全(>9%)目收有一致性，没有明显的代 谢物机案，如乙醇、循酸盐或甘油。发现浮在培养物表面。 在培养基换成以葡萄糖为唯一碳源后，空我体Pˉ对照商株从连续培养中法脱（图1）。面着
结果 L-肉毒碱添加到 Pdc—酿酒酵母连续培养中。最近表明酿酒酵母不能合成 L-肉毒碱（39）。如果 肉毒碱营养缺陷型是 Pdc— 酿酒酵母需要 C2 化合物的原因，需氧生长、低葡萄糖的连续培养应该可 以改为添加 L-肉毒碱。为了研究这一可能性，做对照组连续培养，Pdc—菌株 RWB893（YEplac181） 以添加了 0.4g/L 肉毒碱的葡萄糖和醋酸盐作为碳源。培养基中添加 L-肉毒碱和不添加相比，不影 响单位体积内菌体的碳产量（14.1g/mol），也不影响葡萄糖（1.07mmol/g/h），醋酸盐（0.4mmol/g/h）， O2（2.95mmol/g/h），或 CO2（3.00mmol/g/h）的流量（表 3）。当达到稳定状态后，培养基会被换成 以葡萄糖为唯一碳源但仍包含 L-肉毒碱的培养基。在这个培养基中，Pdc—菌株从连续培养中洗脱。 显然，添加 L-肉毒碱不能援救以葡萄糖为唯一碳源的连续培养中的 Pdc— 酿酒酵母。 Pdc— 酿酒酵母中苏氨酸醛缩酶过量生产。除了 PDS，酿酒酵母的新陈代谢网至少包含一种可选 择的反应能提供细胞溶质的 C2 化合物。苏氨酸醛缩酶（EC 4.2.1.5），GLY1 基因编码的合成氨基乙 酸的关键酶，催化苏氨酸分解为氨基乙酸和乙醛（21，25）。为研究苏氨酸醛缩酶是否会取代 PDC 在其生物合成中的角色，我们尝试在 pdc1Δpdc5Δpdc6Δ菌株中过表达 C2 化合物 C2 化合物 GLY1。 为判定引入 GLY1 的表达菌是否会导致苏氨酸醛缩酶的高活力，酶活力在细胞液中测量。携带 GLY1 表达菌的 Pdc—菌株的苏氨酸醛缩酶活力是 0.75±0.01 U mg/蛋白，然而相应空载体菌株的活 力低于最低检出量 0.005 U mg/蛋白。 为研究过量生产的 Gly1p 的亚细胞定位，苏氨酸醛缩酶活力从低葡萄糖的连续培养中获得的细 胞匀浆中的可溶部分和微粒部分决定。细胞溶质酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在匀浆中的可溶部分全部 回收。线粒体标志酶，细胞色素 c 氧化酶的活力基本上专门位于特殊部分。过量生产菌株中苏氨酸 醛缩酶活力基本上专门发现于细胞匀浆的可溶部分（表 2），说明了 Gly1p 的细胞溶质定位。 GLY1 过表达消除 Pdc— 酿酒酵母对 C2 化合物的需求。在低葡萄糖连续培养中，Pdc— 酿酒酵母的 生长需要添加少量乙醇或醋酸盐于葡萄糖培养基中（10）。像其它 Pdc—突变一样，Gly1p-过生产 Pdc —菌株不能生长于添加葡萄糖的分批培养中，即使存在少量乙醇或醋酸盐（数据为给出）也不能生 长。因此，为验证 Gly1p-过生产菌株和空载体对照菌株生长能力，把以葡萄糖为唯一碳源，以 0.10/h 稀释率生长的需氧混合培养基换成以葡萄糖为唯一碳源的培养基。 正如所料，两种菌株都能在混合了葡萄糖和醋酸盐的连续培养中生长（表 3）。在这种条件下， 培养物的关键生理学参数，如单位体积菌体的产量和呼吸商（RQ），对这两种菌株而言没有明显的 不同（表 3）。培养基中单位体积生物碳和二氧化碳的完全（＞97%）回收有一致性，没有明显的代 谢物积聚，如乙醇、醋酸盐或甘油，发现浮在培养物表面。 在培养基换成以葡萄糖为唯一碳源后，空载体 Pdc—对照菌株从连续培养中洗脱（图 1）。随着
葡萄糖和丙酮酸盐的积聚，单位体积生物浓度成指数下降和0.03/h的低剩余生长率一数。先前证 明不同基因的Pcˉ酿酒醇母以相似的方式从连续培养物中洗輕(12)，显然，对题南株不能在0,10/ 的稀释率下推持无留酸盐的低葡萄糖生长。 同群条件下，苏氨酸醛缩刷-过生产P菌株能够以葡萄糖为在一孩源生长（表3），说明苏氨 酸醛缩酶能提供细散足够的合成雏胞溶质乙酰-CA的前体。相似条件下，G1y1一过生产菌株单位体 积内商体获得的葡萄糖产量(0.47±0.01x/葡萄糖)与从野生型菌株获得的产量(0.48-0.9g/ptt) 相近，G1y一过生产菌株稳态培养副产品形成可以忽略，这说明苏氨酸醛缩酶额外的氨基乙酸生产 既不是低葡面糖连续培养物的异化作用也不是其同亿作用。工程黄也能在Q15/h稀释率低葡面糖 下生长（表3）.然而，当尝试进一步增如稀释率为020/h时导致菌体冲失。 渴示葡萄糖限（培养变为藏葡糖过度培养制产物的形成。为研究苏氨酸醛缩酶过表达P回 株对额外葡面糖的短期应答，对稳态、需氧、低葡萄糖的连续培养给予葡萄糖脉冲，当给予一个50W 的葡萄糖脉冲后，原养型对照南株C飞K113-7D需要来完全消耗添加的葡萄糖。葡司糖的消耗 件随着50乙醇和10W静酸盐的生成（图2），在相同条件下，苏氨酸整缩酶位-过生产Pd 菌株需要4h来光全消耗葡萄糖账冲。没有乙醇减醋酸盐的生成，但对型于野生型菌株，相椒于不 同基因的P菌株(13)，工程菌生产大量的丙酮酸盐（等于30N:图2）. TA) Vas Br 40士01 40士1 40±02 147±00 1目士 L0g士5 L1T士3 地主0更 04士#0 04±09 0我士7 日土的 2汤士4过 4年生g0 104土初 2知土的 0生g0 10生时 100生的 1国生单日 10创生g00 0生套 VT H 2 0 纸生。 。减47 表3.苏氨酸整缩酶-过生产Pdeˉ酿清酵母菌株893(YEpGLY1)和空载体对魔Pdc菌株 B993(YEplac181)在需氧连线培养中的生理学数据” ·平均数和标准误差米自复制实验一一包含葡萄糖和替酸盐的混合物(0,2刚培养基碳和10%以 碳为主要元素的酯整盐)或只有面萄糖《05V培养基碳)的合成培养基的独立拉态培养。碳回收 的计算基于8的单位体积内生物碳容量(wt/t。位1代表B893(EGLY1)
葡萄糖和丙酮酸盐的积聚，单位体积生物浓度成指数下降和 0.03/h 的低剩余生长率一致。先前证 明不同基因的 Pdc— 酿酒酵母以相似的方式从连续培养物中洗脱（12）。显然，对照菌株不能在 0.10/h 的稀释率下维持无醋酸盐的低葡萄糖生长。 同样条件下，苏氨酸醛缩酶-过生产 Pdc—菌株能够以葡萄糖为唯一碳源生长（表 3），说明苏氨 酸醛缩酶能提供细胞足够的合成细胞溶质乙酰-CoA 的前体。相似条件下，Gly1p-过生产菌株单位体 积内菌体获得的葡萄糖产量（0.47±0.01g/葡萄糖）与从野生型菌株获得的产量（0.48-0.49g/ptt） 相近。Gly1p-过生产菌株稳态培养副产品形成可以忽略。这说明苏氨酸醛缩酶额外的氨基乙酸生产 既不是低葡萄糖连续培养物的异化作用也不是其同化作用。工程菌也能在 0.15/h 稀释率低葡萄糖 下生长（表 3）。然而，当尝试进一步增加稀释率为 0.20/h 时导致菌体冲失。 揭示葡萄糖限制培养变为葡萄糖过度培养副产物的形成。为研究苏氨酸醛缩酶-过表达 Pdc—菌 株对额外葡萄糖的短期应答，对稳态、需氧、低葡萄糖的连续培养给予葡萄糖脉冲。当给予一个 50mM 的葡萄糖脉冲后，原养型对照菌株 CEN.PK113-7D 需要 2h 来完全消耗添加的葡萄糖。葡萄糖的消耗 伴随着 50mM 乙醇和 10mM 醋酸盐的生成（图 2）。在相同条件下，苏氨酸醛缩酶 GLY1-过生产 Pdc— 菌株需要 4h 来完全消耗葡萄糖脉冲。没有乙醇或醋酸盐的生成，但对照于野生型菌株，相似于不 同基因的 Pdc—菌株（13），工程菌生产大量的丙酮酸盐（等于 30mM；图 2）。 表 3.苏氨酸醛缩酶-过生产 Pdc— 酿酒酵母菌株 RWB893（YEpGLY1）和空载体对照 Pdc—菌株 RWB893（YEplac181）在需氧连续培养中的生理学数据 a a 平均数和标准误差来自复制实验——包含葡萄糖和醋酸盐的混合物（0.25M 培养基碳和 10%以 碳为主要元素的醋酸盐）或只有葡萄糖（0.25M 培养基碳）的合成培养基的独立稳态培养。碳回收 的计算基于 48%的单位体积内生物碳容量（wt/wt）。GLY1 代表 RWB893（YEpGLY1）
35 25 3.0 20 星 2.5 2.0 15 esoonj9 15 10 20 30 40 Ttme《h) FIC.1.Concentrations of glucose,metabolites and biomans after a switch to an aerobic chemostat culture (dilution rate 0.10 h)of the pdlel△Pe5△k春△eference strain RWB893 YEplac l8I)om growth on synthetic medium containing a mixture of glucose and acetate (0.25 M subutrate carbon and 10%acctate on a carbon basis) to growth on a synthetic medium containing glucose (0.25 M subetrate carbon)as the sole carbon source.The graph shows the washout profile of a single representative culture.An independent replicate experiment yielded the same results. 图1.第萄糖、代谢物浓度和k/△Pk5△P成5△对照商株RB93(Eplacli8】)从生长于包含 葡萄糖和醋酸盐的混合物(Q.25V培养基碳和1体以碳为主要元素的隆酸盐)的合成培养基变为生 长于葡萄糖(0.25训培养基骤)为难一骤源的合成培养基的需氧连续培养（稀释率=0,10/）的单位 体积生物量。曲线显示了单一有代表性的培养物的冲失侧面图。复制实验得到相同结果。 讨论 P-基因缺失的酸酒酵母对G2复合物的需求可以用来反映C蛋白质在合成散质乙酰辅酶A 时的重要作用.可获取的证据表明酿酒酵母不能进行左旋肉碱的原发性合成。在缺少辅因子的合成 煤介生长的过程中，这个结果可能预示了左旋肉碱穿校过程的产生。穿校过程是指将线校体的乙酰 辅酶A运出到组散质中。我们的结果表明轮缺陷型配酒酵母对C包复合体的雷求不是仅仅由左 肉碱营养缺路体迹成的。这个不一定能推断出线校体肉碱在酸酒酵母中的穿梭是单向的，就如之简 以加绿陷型简株的表型和这种酵母可以进行左旋肉碱的生物合成的猜想为依据被提出的情况一 样。然面，添加左旋肉碱的影响的缺失可能反映了左旋肉碱被吸收并通过酵母质膜的能力有限。正 如最近己在拥有不同遗传背景的酿清酵母中正明的一样，只要对酸酒醇母对左旋肉碱吸收的生化反 应和挖制机理以及其新成代谢有了更好的理解，p加缺陷菌株将会对在线粒体乙酸转酶A的运输中 的左旋肉碱穿梭作用的研究常有用。 处于低速的适度特定的生长速率，实验观察有高产苏氨酸缩酶的缺陷菌株能够以葡简糖
图 1.葡萄糖、代谢物浓度和 pdc1Δpdc5Δpdc6Δ对照菌株 RWB893（YEplac181）从生长于包含 葡萄糖和醋酸盐的混合物（0.25M 培养基碳和 10%以碳为主要元素的醋酸盐）的合成培养基变为生 长于葡萄糖（0.25M 培养基碳）为唯一碳源的合成培养基的需氧连续培养（稀释率=0.10/h）的单位 体积生物量。曲线显示了单一有代表性的培养物的冲失侧面图。复制实验得到相同结果。 讨论 Pdc- 基因缺失的酿酒酵母对 C2 复合物的需求可以用来反映 PDC 蛋白质在合成胞质乙酰辅酶 A 时的重要作用.可获取的证据表明酿酒酵母不能进行左旋肉碱的原发性合成。在缺少辅因子的合成 媒介生长的过程中，这个结果可能预示了左旋肉碱穿梭过程的产生。穿梭过程是指将线粒体的乙酰 辅酶 A 运出到细胞质中。我们的结果表明 pdc 缺陷型酿酒酵母对 C2 复合体的需求不是仅仅由左旋 肉碱营养缺陷体造成的。这个不一定能推断出线粒体肉碱在酿酒酵母中的穿梭是单向的，就如之前 以 pdc 缺陷型菌株的表型和这种酵母可以进行左旋肉碱的生物合成的猜想为依据被提出的情况一 样。然而，添加左旋肉碱的影响的缺失可能反映了左旋肉碱被吸收并通过酵母质膜的能力有限，正 如最近已在拥有不同遗传背景的酿酒酵母中证明的一样。只要对酿酒酵母对左旋肉碱吸收的生化反 应和控制机理以及其新成代谢有了更好的理解，pdc 缺陷菌株将会对在线粒体乙酰辅酶 A 的运输中 的左旋肉碱穿梭作用的研究非常有用。 处于低速的适度特定的生长速率，实验观察有高产苏氨酸醛缩酶的 pdc 缺陷菌株能够以葡萄糖
为原料进行生长，萄萄糖作为其单一碳源，这些结果与推断的PC在胞质乙酰编醇A的合成中起五 作用是一致的.通过苏氨酸醛缩酶的高产而生成的乙醛的过程件随着体积克分子浓度相等量的甘氨 酸的形成，在萄萄糖的量很有限时，脂质和氨酸的生物合成对质乙酰轴酶A的最少浓度需求在之 前被估计为1,05mml/g因此，在苏氨酸盛缩能化下，至少会有1,05ml/g浓度的胞质乙酰轴 A被生成。复合通路会发生在GLY1被过度表达的Pc缺失的南株的甘氨酸的代谢中。除了细胞蛋白 的直接吸收（醇母生物量中的甘氨破含量为Q.29m01/g,甘氨酸可能被利用于丝氨酸的合成，通 过了丝氨酸羟甲基转移酶和甘氨酸分解系统。如果所有丝氨酸以这种方式被合成，一分子丝氨酸将 消托两分子甘氨酸，也就是说额外的0.371/g甘氨酸会被合成到总的生物量。除此之外，额外 的甘氨酸可能会通过与甲硫氨酸的生物合成或者单碳化合物的代谢相结合的甘氨酸分解系统而被 转化。 P缺陷菌株不能以葡萄糖作为单一碳源生长表明CLY1基因的调节作用和G1ylp基因的调节作 用与动力学性质。Gly1p可以阻止天然GL门基因达到细胞对胞质乙酰辅酶A的需求。就Glylp基因 的调节特性而言，对天然G1Y1基因调节可能主要是以它在氨代谢中的作用为基础。至于其动力学性 质，苏氨酸缩酶在胞内苏氨酸生理浓度为510时，其对于苏氨酸的低亲和力可能限制了通过 酶的苏氨酸的流出。我们不能排除低程度表达的GLY1会促进低程度的后续特定的生长率的可能性 一旦将在恒化器培养的P缺陷的对照菌株转移到含有作为单一碳源的葡萄糖的培养基中就能观察 到这样的后续生长。在C缺失的真核生物中，关于苏氢酸醛缩酶是否参与了胞内的乙酰辅酶A的 生物合成的研究将会非常有趣。 野生型酿酒酵母发酵产生乙醇和醋酸盐是氧的过程，这被认为是在以生物量和蛋白质量为导 向的工业应用中的实质性问慝。在有氧的且碳源限制的恒化器培养中，被造的Pc缺陷，GLY门 过量表达的南株既可以不进行乙醇的发醇，又有以葡萄糖作为单一碳源生长的能力。然而，作为表 达异源蛋白的寄主或者作为生产左旋乳酸的菌株平台，这种菌株的少许生长特征限制了工业的应 用。首先，和C被减少表达的菌株相似，作葡萄糖限量的恒化器培养中，工程菌相对于野生菌株 0.8/小的速率，只表达了被减少为0.20/h的最大特征生长率。第二点，与C蛋白活性被减少或缺 失的其他酿酒酵母的茵株相似，它在猫萄糖过量的环境中会生产出一定量的丙稠酸。第三，在分批 培养中，依赖于葡萄糖的这种菌株的生长将是无法实现的
为原料进行生长,葡萄糖作为其单一碳源,这些结果与推断的 PDC 在胞质乙酰辅酶 A 的合成中起重要 作用是一致的.通过苏氨酸醛缩酶的高产而生成的乙醛的过程伴随着体积克分子浓度相等量的甘氨 酸的形成.在葡萄糖的量很有限时,脂质和赖氨酸的生物合成对胞质乙酰辅酶 A 的最少浓度需求在之 前被估计为 1.05mmol/g.因此，在苏氨酸醛缩酶催化下,至少会有 1.05mmol/g 浓度的胞质乙酰辅酶 A 被生成。复合通路会发生在 GLY1 被过度表达的 Pdc 缺失的菌株的甘氨酸的代谢中。除了细胞蛋白 的直接吸收（酵母生物量中的甘氨酸含量为 0.29mmol/g），甘氨酸可能被利用于丝氨酸的合成，通 过了丝氨酸羟甲基转移酶和甘氨酸分解系统。如果所有丝氨酸以这种方式被合成，一分子丝氨酸将 消耗两分子甘氨酸，也就是说额外的 0.37mmol/g 甘氨酸会被合成到总的生物量。除此之外，额外 的甘氨酸可能会通过与甲硫氨酸的生物合成或者单碳化合物的代谢相结合的甘氨酸分解系统而被 转化。 Pdc缺陷菌株不能以葡萄糖作为单一碳源生长表明GLY1基因的调节作用和Glylp基因的调节作 用与动力学性质。Glylp 可以阻止天然 GLY1 基因达到细胞对胞质乙酰辅酶 A 的需求。就 Glylp 基因 的调节特性而言,对天然 GLY1 基因调节可能主要是以它在氮代谢中的作用为基础。至于其动力学性 质，苏氨酸醛缩酶在胞内苏氨酸生理浓度为 5-10mM 时，其对于苏氨酸的低亲和力可能限制了通过 酶的苏氨酸的流出。我们不能排除低程度表达的 GLY1 会促进低程度的后续特定的生长率的可能性， 一旦将在恒化器培养的 Pdc 缺陷的对照菌株转移到含有作为单一碳源的葡萄糖的培养基中就能观察 到这样的后续生长。在 PDC 缺失的真核生物中，关于苏氨酸醛缩酶是否参与了胞内的乙酰辅酶 A 的 生物合成的研究将会非常有趣。 野生型酿酒酵母发酵产生乙醇和醋酸盐是需氧的过程，这被认为是在以生物量和蛋白质量为导 向的工业应用中的实质性问题。在有氧的且碳源限制的恒化器培养中，被改造的 Pdc 缺陷，GLY1 过量表达的菌株既可以不进行乙醇的发酵，又有以葡萄糖作为单一碳源生长的能力。然而，作为表 达异源蛋白的寄主或者作为生产左旋乳酸的菌株平台，这种菌株的少许生长特征限制了工业的应 用。首先，和 PDC 被减少表达的菌株相似，在葡萄糖限量的恒化器培养中，工程菌相对于野生菌株 0.38/h 的速率,只表达了被减少为 0.20/h 的最大特征生长率。第二点，与 PDC 蛋白活性被减少或缺 失的其他酿酒酵母的菌株相似，它在葡萄糖过量的环境中会生产出一定量的丙酮酸。第三，在分批 培养中，依赖于葡萄糖的这种菌株的生长将是无法实现的
40 20 20 8佰阳e明明 20 300 Timeminl 40 ◆ 00 40 Time【min】 FIG.2.Meta CEN 3 rain)(B)GLY7 ntially the 图2.需氧、萄限制的连续培莽对50葡萄糖脉冲的新陈代谁应答。(A)酿消酵母C.P 113-D(原养野生型茵株).(B)C7-过生产Pdc菌株893(YEpGLY1).曲线说明对每一茵株 的单一有代表性的葡萄糖脉冲实坠。独立复制实验本质上得到形同结果
图 2.需氧、葡萄糖限制的连续培养对 50mM 葡萄糖脉冲的新陈代谢应答。（A）酿酒酵母 CEN.PK 113-7D（原养野生型菌株）。（B）GLY1-过生产 Pdc—菌株 RWB893（YEpGLY1）。曲线说明对每一菌株 的单一有代表性的葡萄糖脉冲实验。独立复制实验本质上得到形同结果