第六章大分子的分离和分析 第一节DNA的分离、检测和纯化☆ 第二节RNA的分离、检测和纯化 第三节分子杂交☆ 第四节RNA作图和端点分析 第五节重组DNA分子导入大肠杆菌
第六章 大分子的分离和分析 第一节 DNA的分离、检测和纯化 第二节 RNA的分离、检测和纯化 第三节 分子杂交 第四节 RNA作图和端点分析 第五节 重组DNA分子导入大肠杆菌
第一节DNA的分离、检测和纯化 E.coli质粒DNA的分离和纯化 (一) 质粒DNA的小量提取 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法 依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等 特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高，提 取的质粒DNA可用于酶切，连接与转化
一、E.coli质粒DNA的分离和纯化 （一）质粒DNA的小量提取 第一节 DNA的分离、检测和纯化 ✓ 碱变性法； ✓ 煮沸法； ✓ SDS法； ✓ 羟基磷灰石层析法 ✓ 依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等 特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提 取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化
第一碱变性法提取质粒的基本原理 在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体 DNA变性分开，而共价闭环质粒DNA仍缠绕在一起。 ■将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之 间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污 剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复为可溶状态， 通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋 白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化 质粒DNA
第一 碱变性法提取质粒的基本原理 ▪ 在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体 DNA变性分开，而共价闭环质粒DNA仍缠绕在一起。 ▪ 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之 间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污 剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复为可溶状态， 通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋 白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化 质粒DNA
步骤： 1、离心收集细菌培养物 细菌培养物的生长量：一般选择对数生长期的大肠杆菌细 胞提取质粒。 时间：过夜培养 对于RNA分子调控复制的质粒可采用此期加入氯霉素来提 高质粒的拷贝数
1、离心收集细菌培养物 细菌培养物的生长量：一般选择对数生长期的大肠杆菌细 胞提取质粒. 时间：过夜培养 对于RNA分子调控复制的质粒可采用此期加入氯霉素来提 高质粒的拷贝数. 步 骤:
步骤： 2、沉淀中加100μ用冰预冷的溶液，充分混合（需要剧 烈振荡)。室温下放置10min。 溶液工的作用使细菌培养物质充分悬浮。 组成： 50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCI (pH8.0) 10 mM EDTA ·可成批配制，在高压下蒸气灭菌15min,贮存于4C
2、沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I，充分混合（需要剧 烈振荡）。室温下放置10 min。 溶液Ⅰ的作用使细菌培养物质充分悬浮。 组成： 50 mM 葡萄糖 25 mM Tris·HCl（pH8.0） 10 mM EDTA •可成批配制，在高压下蒸气灭菌15 min，贮存于４℃。 步 骤:
√葡萄糖的作用：增加溶液的粘度，使悬浮后的大肠杆 菌不会很快沉积到管底；维持渗透压及防止DNA受机械 剪切力作用而降解。 √EDTA是Ca和Mg等二价金属离子的螯合剂，在溶液！ 中加入EDTA,是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子 都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制 微生物生长的作用
✓葡萄糖的作用：增加溶液的粘度，使悬浮后的大肠杆 菌不会很快沉积到管底；维持渗透压及防止DNA受机械 剪切力作用而降解。 ✓EDTA是Ca和Mg等二价金属离子的螯合剂，在溶液I 中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子 都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制 微生物生长的作用
3、加入200溶液川，加盖后轻轻快速颠倒离心管数 次混匀（千万不要振荡），冰浴5min。 溶液Ⅱ的作用是使细菌细胞破裂释放DNA,同时在碱 性条件下DNA发生变性。 组成： 0.2 N NaOH、1%SDS 这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免 NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性
3、加入200μl溶液 II，加盖后轻轻快速颠倒离心管数 次混匀（千万不要振荡），冰浴5 min 。 溶液Ⅱ的作用是使细菌细胞破裂释放DNA，同时在碱 性条件下DNA发生变性。 组成： 0.2N NaOH、1% SDS 这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免 NaOH接触空气中的 CO2而减弱了碱性
NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是 哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于 细胞膜发生了从bilayer（双层膜)结构向micelle（微 囊)结构的相变化。 核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当 pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而 变性。 用不新鲜的0.4 N NaOH,即便有SDS也无法有效溶解 大肠杆菌
NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是 哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于 细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微 囊）结构的相变化。 核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当 pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而 变性。 用不新鲜的0.4 N NaOH，即便有SDS也无法有效溶解 大肠杆菌
十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂，它既能 使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌 后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA。 主要作用是： A、溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。 B、解聚细胞中的核蛋白。 C、能与蛋白质结合成为蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉 淀下来。 SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必 须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能 使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌 后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA 。 主要作用是： A、溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。 B、解聚细胞中的核蛋白。 C、能与蛋白质结合成为蛋白质复合物，使蛋白 质变性而沉 淀下来。 SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必 须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行
4、加入150μl预冷溶液l,轻轻颠倒数次混匀 (10s),置于冰浴15min。 溶液Ⅲ：钾离子浓度为3mol/L,醋酸根离子浓度为5mol/L pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中 性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。 圈
4、加入150 μl预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀 （10s），置于冰浴15 min 。 溶液Ⅲ：钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L. pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中 性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在