第一节PCR工作原理和方式 第二节PCR产物的克隆方法 第三节扩增未知DNA的PCR 第四节与反转录相关的PCR 圈 第五节PCR产生DNA指纹 第六节实时定量PCR 圈 圈
第一节 PCR工作原理和方式 第二节 PCR产物的克隆方法 第三节 扩增未知DNA的PCR 第四节 与反转录相关的PCR 第五节 PCR产生DNA指纹 第六节 实时定量PCR
第八章PCR技术及其应用 PCR:polymerase chain reaction 聚合酶链式反应。 概念：通过体外模拟体内DNA复制的方式，在体外选择 性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。 ■基于DNA在生物体内的复制模式而设计的 体内复制过程： DNA解旋酶、，解链酶解开双链 引物酶合成RNA引物 DNA聚合酶引导DNA5'-3'合成
第八章 PCR技术及其应用 ▪ PCR：polymerase chain reaction ▪ 聚合酶链式反应。 ▪ 概念：通过体外模拟体内DNA复制的方式，在体外选择 性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。 ▪ 基于DNA在生物体内的复制模式而设计的 体内复制过程： DNA解旋酶、解链酶解开双链 引物酶合成RNA引物 DNA聚合酶引导DNA5’-3’合成
DNA,生命的蓝图 年g年年年g年g年年年 31 cG G The two strands of the parental double helix unwind, and each specifies a new daughter strand by base-pairing rules Old Old -AT A CG New Minor Major ●●V groove -TA TA 5 3 B.DNA(B conformation) CG
DNA， 生命的蓝图
PCR的发明 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适 引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重 复该过程便可克隆基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因 工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以， Khorana的设想被人们遗忘了. 1983年的春夏之交，Mullis先生的一次意外之旅，在 美国加州的101国道上产生了PCR技术
1983年的春夏之交，Mullis先生的一次意外之旅，在 美国加州的101国道上产生了PCR技术。 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适 引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重 复该过程便可克隆基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因 工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以， Khorana的设想被人们遗忘了. PCR的发明
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖，Mullis是其中之一 Kary B.Mullis (1944-), Cetus公司工作期间，发明了 PCR。 他原本是要合成DNA引物来 进行测序工作，却常为没有 足够多的模板DNA而烦恼。 1983年春夏之交的一个晚上， 他开车去乡下别墅的路上萌 发了用两个引物（而不是一 个引物)去扩增模板DNA的 想法
Kary B. Mullis (1944 -)，在 Cetus公司工作期间，发明了 PCR。 他原本是要合成DNA引物来 进行测序工作，却常为没有 足够多的模板DNA而烦恼。 1983年春夏之交的一个晚上， 他开车去乡下别墅的路上萌 发了用两个引物（而不是一 个引物）去扩增模板DNA 的 想法. 很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖， Mullis是其中之一
Separate strands Anneal primers Tag polymerase extends primers (c) Separate strands Anneal primers (d) MIullis开车的时候，瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的 车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的 车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，
Mullis的第一个PCR实验 New stand 000A DNApolymerase Leading template -Single-standed DNA binding proteins Lagging template RNA primer 000000 Parental DNA DNA primase DNA polymerase Okasaki fragment Collaboration of Proteins at the Replication Fork 1983年9月中旬。Muis在反应体系中加入DNA聚合酶后 在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任 何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后 再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月， 他终于看到了被同位素标记的PCR条带
Mullis的第一个PCR实验 ▪ 1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后 在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任 何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后 再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月， 他终于看到了被同位素标记的PCR条带
发展史 1983年春，MulIis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mulis/用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验， 只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的 第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science.上发了一篇论文， 方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PC的专利，1987年7月28日批准（专利 号4,683,202)，这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，MulIis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开 始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase,这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRochel以3亿美元的代价从Cetus公司获得全 权开发权
发展史 ▪ 1983年春，Mullis发展出PCR的概念； ▪ 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验， 只用一个循环； ▪ 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的 第一个PCR片断； ▪ 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文， 方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； ▪ 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利 号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 ▪ 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开 始学习PCR的方法； ▪ 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； ▪ 1988年，第一台PCR仪问世； ▪ 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全 权开发权
RESEARCH ARTICLE Enzymatic Amplification of B-Globin The authors are in the Department of Human Genomic Sequences and Restriction Site Genetics,Cetus Corporation,1400 Fifty-Third Street,Emeryville,California 94608.The present Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia address for N.A.is Department of Biological Sci- ences,University of Southern California.Los Ange- 1es90089-0371. Randall K.Saiki.Stephen Scharf,Fred Faloona.Kary B.Mullis Glenn T.Horn,Henry A.Erlich,Norman Arnheim SCIENCE,VOL.230 States Patent 46B3202 *July28,1987 for amplifying nucleic acid sequences Inventors: Iullis:Kary B.(Kensington,CA) Assignee: Cetus Corporation (Emeryville,CA) [+Notice:The portion of the term of this patent subsequent to July 28,2004 has been disclaimed. Appl.No.: 791308 Filed: October 25,1985
PCR不只是一个方法改进 Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么 多DNA样品有什么用”； ■到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR 相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并 在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA 重组技术一样意义深远
PCR不只是一个方法改进 ▪ Mullis的上司有句“名言” ， “我们要扩增这么 多DNA样品有什么用” ； ▪ 到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR 相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche 公司，并 在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； ▪ Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA 重组技术一样意义深远