第三章」 分子克隆载体 引言(introduction) 第一节质粒载体 (plasimid vectors） 第二节噬菌体载体(phage vectors). 园 第三节单链丝状噬菌体载体 函 2
2 第三章 分子克隆载体 引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 λ噬菌体载体（phage vectors） 第三节 单链丝状噬菌体载体
第二节入phage vectors 噬菌体是一类细菌病毒 (Bacteriophage) 结构： 蛋白质外壳内包裹 着DNA（双链、单 链、线性、环状 等) 6 3
3 第二节 phage vectors 噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。 结构： 蛋白质外壳内包裹 着DNA（双链、单 链、线性、环状 等）
一、入噬菌体的分子生物学 1.入DNA分子的特点 (1) 长度为48502bp; (2) 双链线性DNA; (3) 但在两端有cos位点，可以环化。 c0s位点 (cohensive-end site) 超 入DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末 端形成的双链区域称为cos位点。 4
4 一、噬菌体的分子生物学 （1）长度为48502 bp； （2）双链线性DNA； （3）但在两端有cos位点，可以环化。 DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末 端形成的双链区域称为cos位点。 1. DNA分子的特点 cos位点（cohensive-end site）：
A map of phage入，showing the major genes. Regulator of入 cl,and int gene expression Regulator of cl gene Phage DNA Regulator replication of early genes 入repressor proteins cro Stabilizer cⅡ of cll protein Regulator Phage of late genes recombination PRMPRE Q proteins OL:PL OR PE Origin Lysis Excisionase of replication R proteins (for excision from Early promoters A chromosome】 xis and operators PR Late gene Integrase int Cutting of promoter Nul (for integration DNA at into chromosome cos site for A Terminase packaging -48kb Nu3 Genes for head proteins 7 and assembly 非必需区 F11 Genes for tail proteins and assembly
5 非必需区
(一)λ发育调节 λ噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方式，即 溶菌性反应与溶源性反应。 在感染早期，当入噬菌体DNA进入宿主细胞后，其 两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA分子，而后 在宿主细胞的DNA连接酶和旋促酶(gyrase)作用 下，形成封闭的环状DNA分子，充当转录的模板。 ·溶原溶菌的选择和分化问题. 6
6 （一）发育调节 ▪ λ噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方式，即 溶菌性反应与溶源性反应。 ▪ 在感染早期，当 噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其 两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后 在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用 下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。 ▪ 溶原溶菌的选择和分化问题
溶原、溶菌分化 环境条件：营养差溶原，营养丰富时降解CⅡ的宿主 蛋白酶被激活，那么噬菌体倾向于裂解细胞。 cAMP: 调节启动子，高促进溶原、低溶菌 感染复数：感染时噬菌体与细菌的比例。 CⅡ蛋白的单体不稳定、没有活性，只有形成二聚体 才具活性。少噬菌体时产生的CⅡ很少，不足以形成 二聚体，倾向于裂解；当感CⅡ的浓度增加，有利溶 原化。 c蛋白：激活转录、抑制裂解基因的表达，促进溶原
7 环境条件：营养差溶原，营养丰富时降解CⅡ的宿主 蛋白酶被激活，那么噬菌体倾向于裂解细胞 。 cAMP： 调节启动子，高促进溶原、低溶菌 感染复数：感染时噬菌体与细菌的比例。 CⅡ蛋白的单体不稳定、没有活性，只有形成二聚体 才具活性。少噬菌体时产生的CⅡ很少，不足以形成 二聚体，λ倾向于裂解；当感CⅡ的浓度增加，有利溶 原化。 cII蛋白：激活转录、抑制裂解基因的表达，促进溶原 溶原、溶菌分化
溶原化和裂解平衡关键是CI和Cro之间的对抗： 发生转换的关键是CⅡ。 若CIⅡ是有活性的，通过Pre启动子有效地合成阻遏 物CI,结果CI占据操纵基因OL和OR,启动溶原。 若CⅡ无活性，阻遏物CI不能合成，Cro就结合于操 纵基因OR上，启动裂解。 腿 8
8 溶原化和裂解平衡关键是CI和Cro之间的对抗： 发生转换的关键是CⅡ。 若CⅡ是有活性的，通过Pre启动子有效地合成阻遏 物CI ，结果CI占据操纵基因OL和OR ，启动溶原。 若CⅡ无活性，阻遏物CI不能合成，Cro就结合于操 纵基因OR 上，启动裂解
、噬菌体的选择标记 （入的生物学特性) 1、B半乳糖苷酶失活型载体： 在入基因组中引入了Lc☑'序列。（其上含有一个 EcoR I克隆位点)。 LacZ' EcoR I 超 选择标记： 感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用 XgaI的显色反应作选择标记
9 二、噬菌体的选择标记（ 的生物学特性） 1、-半乳糖苷酶失活型载体： 在基因组中引入了LacZ’序列。（其上含有一个 EcoR I 克隆位点）。 感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用 Xgal的显色反应作选择标记。 LacZ’ EcoR I 选择标记:
2、c基因失活： c蛋白的表达促进噬菌体进入溶原 插入导致载体不能合成阻遏物，载体DNA不能 进入溶源期，受体菌裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的入载体感染受体菌形成混浊 噬菌斑。 超 涵 cl EGoR I
10 cI蛋白的表达促进噬菌体进入溶原 插入导致载体不能合成阻遏物， 载体DNA不能 进入溶源期，受体菌裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的载体感染受体菌形成混浊 噬菌斑。 2、cI基因失活: cI EcoR I
3、Spi-重组体的筛选 >野生型噬菌体不能在携带有P2原噬菌体的溶源菌中生长，) 的这种表型称为Spit(对P2的干扰敏感)。 >当基因组中缺少参与重组的red和gam基因时，突变体便可 以在P2溶原菌中生长，其表型称为Spi-。 >基因red和gam位于非必需区域内，外源DNA片段能置换基因 red和gam形成重组体，其重组体能在recA+的P2溶原菌中繁殖， 并且显示出Spi-的表型。 >因此只要选用ecA+的P2溶原菌作为宿主菌，就可以对重组体 进行筛选。 能浸染宿主菌产生噬菌斑的即是重组分子。但这种噬菌斑小且 少。 11
11 ➢野生型λ噬菌体不能在携带有P2原噬菌体的溶源菌中生长，λ 的这种表型称为Spi+(对P2的干扰敏感)。 ➢当λ基因组中缺少参与重组的red和gam基因时，λ突变体便可 以在P2溶原菌中生长，其表型称为Spi-。 ➢基因red和gam位于非必需区域内，外源DNA片段能置换基因 red和gam形成重组体，其重组体能在recA+的P2溶原菌中繁殖， 并且显示出Spi-的表型。 ➢因此只要选用recA+的P2溶原菌作为宿主菌，就可以对重组体 进行筛选。 能浸染宿主菌产生噬菌斑的即是重组分子。但这种噬菌斑小且 少。 3、Spi-重组体的筛选