第11章文库的构建和目的基因的筛选 第一节基因组DNA文库的构建 第二节cDNA文库的构建 醒第三节基因克隆的筛选策略 圈 2
2 第11章 文库的构建和目的基因的筛选 第一节 基因组DNA文库的构建 第二节 cDNA文库的构建 第三节 基因克隆的筛选策略
长大 外源基因：插入到载体内的那个特定的片段 基因。 目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、 扩增或表达的特定基因或DNA片段。 圈 是 厨 3
3 ▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定的片段 基因。 ▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、 扩增或表达的特定基因或DNA片段
对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大，基因可达数万个， 且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列， 基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因 在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基 因难以直接分离得到。 为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加 成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是 未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因 进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同 的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。 4
4 ▪ 对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个， 且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列， 基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因 在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基 因难以直接分离得到。 ▪ 为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加 成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是 未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因 进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同 的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因
1基因文库(gene library)概念 ■又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片 段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过 一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体）， 所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 ■基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。 冠 园 5
5 1 基因文库(gene library)概念 ▪ 又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片 段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过 一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)， 所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 ▪ 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成
2构建基因文库的基本程序 ■1)提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA片段， 或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA; ■2)DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重 组DNA; ·3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 漫 6
6 2 构建基因文库的基本程序 ▪ 1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段， 或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA； ▪ 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重 组DNA； ▪ 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； ▪ 4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择
3基因文库的分类 按照外源DNA片段的来源： ·基因组DNA文库：从生物组织细胞提取出全部DNA,用物理方 法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当 的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有 一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖 扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合 体，就称为基因组DNA文库。 基因组文库本质是基因组DNA分割为一个个小片段与载体连接后 所构成的重组分子。完整的基因组文库包含该生物基因组DNA全 部的序列，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。 7
7 3 基因文库的分类 按照外源DNA片段的来源： ▪ 基因组DNA文库：从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方 法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当 的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有 一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖 扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合 体，就称为基因组DNA文库。 ▪ 基因组文库本质是基因组DNA分割为一个个小片段与载体连接后 所构成的重组分子。完整的基因组文库包含该生物基因组DNA全 部的序列，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列
基因组DNA 限制性 内切酶 克隆、转化、培养、鉴定 ↓ 基因文库
限制性 内切酶 . 克隆、转化、培养、鉴定 基因组DNA 基因文库
cDNA文库：提取出组织细胞的全部mRNA,在体外反转 录成cDNA,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增， 这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该 组织细胞的cDNA文库。 cDNA文库实际上是一定生长阶段或条件的某种细胞所表 达的基因，是没有内含子的基因文库。 冠 超 9
9 ▪ cDNA文库：提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转 录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增， 这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该 组织细胞的cDNA文库。 ▪ cDNA文库实际上是一定生长阶段或条件的某种细胞所表 达的基因，是没有内含子的基因文库
外显子 结构基因 内含子 转录、如工修饰 mRNA
结构基因 外显子 内含子 转录、加工修饰 mRNA
两种文库最大的区别就在cDNA文库有时空特异性，只 含部分基因的编码框；而基因组文库包含了编码区、 非编码区、内含子、表达调控序列等。 用于基因克隆的DNA材料的选择： ·如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可 以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推 导出来； 如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或 是在mRNA中不存在的某种特定序列，有关这类的信 息就只能从基因组DNA中获得。 11
11 两种文库最大的区别就在cDNA文库有时空特异性，只 含部分基因的编码框；而基因组文库包含了编码区、 非编码区、内含子、表达调控序列等。 用于基因克隆的DNA材料的选择： ▪ 如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可 以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推 导出来； ▪ 如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或 是在mRNA中不存在的某种特定序列，有关这类的信 息就只能从基因组DNA中获得