海南大学 第2节RNA的分离 陈银华 海南大学农学院
海南大学 农学院 第2节 RNA的分离 陈银华
基因操作中，涉及到的RNA主要是mRNA >mRNA在细胞中含量最少。 如：一个动物细胞中总RNA为10-5ug,其中mRNA为1-5%。 >mRNA为单链，容易受到内源或外源核酸酶降解 >核酸酶分布广泛、具有很强的稳定性：抗酸抗碱 很广的pH,抗高温严寒0~65℃)，抗变性剂。 >因此，对RNA的操作比DNA的操作严格的多
基因操作中，涉及到的RNA主要是mRNA ➢mRNA在细胞中含量最少。 如：一个动物细胞中总RNA为10-5 ug，其中mRNA为1-5%。 ➢mRNA为单链，容易受到内源或外源核酸酶降解 ➢核酸酶分布广泛、具有很强的稳定性：抗酸抗碱 很广的pH，抗高温严寒(0~65℃)，抗变性剂。 ➢因此，对RNA的操作比DNA的操作严格的多
制备RNA的关键一控制潜在RNase的活性 1、RNase的特点 特异性的降解RNA的3‘端。 在生物体内、体外广泛存在 同时该酶具有抗酸抗碱，很广pH作用范围，抗 高温严寒(0~65℃均具活性)；抗变性剂等特 点，非常稳定
一、制备RNA的关键—控制潜在RNase的活性 1、RNase的特点 特异性的降解RNA的3‘端。 在生物体内、体外广泛存在 同时该酶具有抗酸抗碱，很广pH作用范围，抗 高温严寒（0~65℃均具活性）；抗变性剂等特 点，非常稳定
2、解决办法 >外源RNase 高温，焦磷酸二乙酯（DEPC)处理所有溶液 (Tris.HC除外)和器皿，操作者带手套。 >内源RNase 高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase:抑制剂， 蛋白酶K等
2、解决办法 ➢外源RNase 高温，焦磷酸二乙酯（DEPC）处理所有溶液 （Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套。 ➢内源RNase 高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂， 蛋白酶K等
溶液和用具的去RNA酶处理 耐热的玻璃制品：高温干热灭菌（150度4-6小时) 一次性塑料用品：0.1%DEPC水泡后灭菌 电泳器具：专用、使用前用3%H202浸泡 可能接触到RNA的溶液都需要用DEPC处理的水配制。 在RNA反应中还需要添加RNA酶抑制剂来防止降解
溶液和用具的去RNA酶处理 耐热的玻璃制品：高温干热灭菌（150度4-6小时） 一次性塑料用品：0.1% DEPC 水泡后灭菌 电泳器具：专用、使用前用3% H2O2浸泡 可能接触到RNA的溶液都需要用DEPC处理的水配制。 在RNA反应中还需要添加RNA酶抑制剂来防止降解
常用的RNA酶(RNase)抑制剂 (1)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H50CO0CO0C2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白 质变性，从而抑制酶的活性。 使用注意： 1)DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白 质变性的浓度大100~1000倍。 2)容易降解，保存在4℃或液氮中； 3)提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37C2h。 4)剧毒
常用的RNA酶（RNase)抑制剂 （1） DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白 质变性，从而抑制酶的活性。 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白 质变性的浓度大100～1000倍。 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 4）剧毒
(2)皂土(bentonite):皂土带负电荷，能吸附RNase,使 其失活。 (3)异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在 裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸 从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 (4)RNase阻抑蛋白(RNasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取 得来的酸性糖蛋白。是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和 多种RNA酶结合，使其失活。 （5)氧铜核糖核苷复合物(Vanady-Ribonucleoside Complex,VRC):由氧化铜离子和核苷形成的复合物它和RNA 酶结合形成过渡态物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性
（2）皂土（bentonite）：皂土带负电荷，能吸附RNase，使 其失活。 （3）异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在 裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸 从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 （4）RNase阻抑蛋白（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取 得来的酸性糖蛋白。是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和 多种RNA酶结合，使其失活。 （ 5 ） 氧 铜 核 糖 核 苷 复 合 物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC)：由氧化铜离子和核苷形成的复合物它和RNA 酶结合形成过渡态物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性
二、RNA提取的通用方法 异硫氰酸胍/苯酚法 硅胶膜纯化法
二、RNA提取的通用方法 ❑ 异硫氰酸胍/苯酚法 ❑ 硅胶膜纯化法
异硫氰酸弧/苯酚法 原 理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体 上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而 分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； ,有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA
❑ 异硫氰酸胍/苯酚法 ➢ 原 理： • 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体 上的蛋白变性，核酸释放； • 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而 分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； • 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA
用 步骤： 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA,有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇，可用氯化锂选择沉淀RNA。 乙酸钠（pH4.0)：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀 RNA. 洗涤：70%乙醇
➢ 步 骤: • 材料准备：尽量新鲜。 • 裂解变性：异硫氰酸胍 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 • 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。 • 沉淀：异丙醇、无水乙醇，可用氯化锂选择沉淀RNA。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀 RNA。 • 洗涤：70％乙醇