第五章 表达载体 第一节大肠杆菌表达载体 第二节穿梭载体 第三节整合载体
第五章 表达载体 第一节 大肠杆菌表达载体 第二节 穿梭载体 第三节 整合载体
引言 实验研究中常常需要大量的蛋白质，如制备抗体。 生化方法很难高效的获得目的蛋白：提取困难、 酶活性保持时间短、体内降解等。 在了解编码基因的条件，如何寻找一种有效的体 外表达体系实现目的蛋白的高效表达成为基因工 程研究的重要内容
实验研究中常常需要大量的蛋白质,如制备抗体。 生化方法很难高效的获得目的蛋白：提取困难、 酶活性保持时间短、体内降解等。 在了解编码基因的条件，如何寻找一种有效的体 外表达体系实现目的蛋白的高效表达成为基因工 程研究的重要内容。 引 言
表达系统： 基因的表达 基因克陛 基 体系， 表达载体 克隆载体 转化受体首 转化受体首 表达蛋白质 复制扩塔
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系， 包括克隆载体，表达载体及受体细胞。 表达系统：
据受体细胞的不同可分为 V I V E 1.原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以 发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2.真核表达系统： 使外源基因在真核细胞中表达的体系
1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以 发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2．真核表达系统： 使外源基因在真核细胞中表达的体系。 据受体细胞的不同可分为
最广泛使用的大肠杆菌表达体系 优越性： 1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机 理有深刻的了解； 2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主 菌株和不同类型的载体； 3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、 高水平的表达； 4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量 生产
优越性： 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机 理有深刻的了解； 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主 菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、 高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量 生产。 最广泛使用的大肠杆菌表达体系
第一节 大肠杆菌表达载体 原核生物的基因结构与表达特点 1 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA,其转 录和翻译是偶联的连续进行。 2. 原核生物形成多顺反子mRNA:mRNA在合成 过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 3、一般不含内含子（intron),没有转录及翻译后 加工系统
第一节 大肠杆菌表达载体 原核生物的基因结构与表达特点 1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转 录和翻译是偶联的连续进行。 2. 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成 过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后 加工系统
氨基酸 RNA 氨基酸○ 1肽链 vF8S86-c0888006E8 mRNA 核糖体
4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵 子；操纵子（operon):是一组功能上相关，受 同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。 5、原核生物中参与转录的基因结构：启动子、终止子、 核糖体结合位点 南十(p 结构阳 E理益丙】 做基因
4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵 子；操纵子（operon）：是一组功能上相关，受 同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。 5、原核生物中参与转录的基因结构：启动子、终止子、 核糖体结合位点
启动子(promoter,P) 指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA 序列。 一般长40-60bp,两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列 组成 -10区（pribnow box):起始点上游5-10bp处，由6-8个 碱基TATAAT -35区：10bp组成 -35区与RNA聚合酶δ亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心 酶结合
指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA 序列。 一般长40-60 bp，两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列 组成 -10区（pribnow box）：起始点上游5-10 bp处，由6-8个 碱基 TATAAT -35区：10 bp 组成 -35区与RNA聚合酶δ亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心 酶结合 启动子(promoter, P)
Operon -35 region Pribnow box Initiation (-10 region) site(+1) lac ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG lael CCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTC galP2 ATTTATTCCATGTCACACTTTTCGCATCTTTGTTATGCTATGGTTATTTCATACCAT araBAD GGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCGTTTTT araC GCCGTGATTATAGACACTTTTGTTACGCGTTTTTGTCATGGCTTTGGTCCCGCTTTG trp AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTA bioA TTCCAAAACGTGTTTTTTGTTGTTAATTCGGTGTAGACTTGTAAACCTAAATCTTTT bioB CATAATCGACTTGTAAACCAAATTGAAAAGATTTAGGTTTACAAGTCTACACCGAAT tRNATYr CAACGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTTCCCGATA rrnD1 CAAAAAAATACTTGTGCAAAAAATTGGGATCCCTATAATGCGCCTCCGTTGAGACGA rrnE1 CAATTTTTCTATTGCGGCCTGCGGAGAACTCCCTATAATGCGCCTCCATCGACACGG rrnAl AAAATAAATGCTTGACTCTGTAGCGGGAAGGCGTATTATGCACACCCCGCGCCGCTG Initiation -35 region Pribnow box site Concensus T C TT G A C A T.11-15bp.T A T AA T.5-8bp. A sequence: 423882847964534541 799544595196 6 T 55 G 48 42 RNA聚合酶6亚基识别-35区，接着核心酶结合在TATA框
consensus sequences RNA聚合酶δ亚基识别-35区，接着核心酶结合在TATA框