R S I T 第四章 人工染色体载体 园 圈 3
3 第四章 人工染色体载体
南 心 、人工染色体产生的背景 噬菌体载体：容量大，但在包装过程中有包装限制，而噬菌 体基因组中有很大一部分片段是包装必须的，因此-DNA载 体和M13-DNA载体的装载量最大分别为23kb和1.5kb; 质粒载体：虽然没有包装限制，但片段越大转化效率越低， 所以容量也是有限的。 有时需要克隆更大片段。 如：鸡前o2胶原、鼠三氢叶酸还原酶(DHFR)至少40kb 湿 4
4 噬菌体载体: 容量大，但在包装过程中有包装限制，而噬菌 体基因组中有很大一部分片段是包装必须的，因此λ-DNA载 体和M13-DNA载体的装载量最大分别为23 kb和1.5 kb； 质粒载体：虽然没有包装限制，但片段越大转化效率越低， 所以容量也是有限的。 有时需要克隆更大片段。 如：鸡前2胶原、鼠三氢叶酸还原酶（DHFR）至少40kb 一 、人工染色体产生的背景
人工染色体载体： >利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片断复 制的载体称为人工染色体载体（Artificial chromosome vector). 如：人类基因组：3000Mb 园 番茄基因组：1000Mb 水稻基因组： 400Mb 爱 大肠杆菌： 4.2Mb 5
5 Ø利用染色体的复制元件来驱动外源ＤＮＡ片断复 制 的 载 体 称 为 人 工 染 色 体 载 体 （ A r t i f i c i a l chromosome vector）. 人工染色体载体： 如：人类基因组： 3000 Mb 番茄基因组： 1000 Mb 水稻基因组： 400 Mb 大肠杆菌： 4.2 Mb
根据复制元件来源分： >粘粒载体(cosmid):-DNA的复制元件 >酵母染色体载体(YAC)：酵母的复制元件 >细菌人工染色体载体(BAC)：F质粒的复制元件 >P1人工染色体载体(PAC):P1的复制元件 >装载片断：4OKb一1O0OKb 超 6
6 Ø粘粒载体（cosmid）： λ-DNA的复制元件 Ø酵母染色体载体（ＹＡＣ）：酵母的复制元件 Ø细菌人工染色体载体（ＢＡＣ）：F质粒的复制元件 ØＰ1人工染色体载体（ＰＡＣ）：P1的复制元件 Ø装载片断：４０Ｋｂ－１０００Ｋｂ 根据复制元件来源分：
第一节粘粒载体 cosmid 一、粘粒的结构特征 cosmid (cos site-carring plasmid) 人工构建的含有DNA的c0s位点序列和质粒复制子的特殊类 型的质粒载体。 构成： ①质粒复制起点（coE1)：象质粒一样转化和增殖 ②抗性标记ampr:方便的筛选 ③cos位点：能被识别包装成噬菌体 它的大小一般5-7kb左右，克隆的最大DNA片段可达45kb 品 7
7 一、粘粒的结构特征 cosmid（cos site-carring plasmid） 人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类 型的质粒载体。 构成： ①质粒复制起点（colE1）： 象质粒一样转化和增殖 ②抗性标记ampr： 方便的筛选 ③ cos位点：能被识别包装成噬菌体 它的大小一般 5-7kb 左右，克隆的最大 DNA 片段可达45kb 第一节 粘粒载体 cosmid
海南 BamΠ Tc PstI Ap SalI pHC79 6400bp 入fragment COS 1978年Collins和Hohn发明构建，1.8kb的-DNA片 段+pBR322片段，装载范g国为31-45kb
8 1978年Collins和Hohn发明构建，1.8 kb的l-DNA片 段 + pBR322片段，装载范围为31 - 45 kb
2、粘粒的特点 ①能象入-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞； ②可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，如 cos区及附近顺序长为1.7kb,质粒长为3.3kb,则该 柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA; ③由于携带质粒的选择标记，便于筛选； ④由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。 9
9 ① 能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞； ②可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，如 cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该 柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA； ③ 由于携带质粒的选择标记，便于筛选； ④ 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。 2、粘粒的特点
南大 3、用途 >在构建基因文库中，减少文库中重组体的数目 >在单个重组体中克隆和增殖完整的（较大的）真核基因 鸡前a2胶原、鼠三氢叶酸还原酶(DHFR)至少40kb 入载体最大24kb,质粒载体虽可携带大片段，但转化率低。 >克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段 涵 如：哺乳动物珠蛋白基因遍布于至少70kb的DNA片段中甚至有数十万 个bp（几百kb) 10
10 Ø在构建基因文库中，减少文库中重组体的数目 Ø在单个重组体中克隆和增殖完整的（较大的）真核基因 鸡前2胶原、鼠三氢叶酸还原酶（DHFR）至少40kb 载体最大24kb，质粒载体虽可携带大片段，但转化率低。 Ø克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段 如：哺乳动物珠蛋白基因遍布于至少70kb的DNA片段中甚至有数十万 个bp（几百kb） 3、用途
在“步查”过程中，粘粒具有优势，是)文库的两倍，粘粒 可克隆45kb 染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作为探 是 针以鉴定含有相邻序列的重组克隆。 湿 11
11 在“步查”过程中，粘粒具有优势，是文库的两倍，粘粒 可克隆45kb 染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作为探 针以鉴定含有相邻序列的重组克隆
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