第九章DNA序列分析 核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一 项重要的技术，该技术的产生与PAGE胶的发展分不 开。 >目前测序的方法： 化学降解法 >末端终止法 DNA测序自动化 1/92
1/92 第九章 DNA序列分析 ➢ 核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一 项重要的技术，该技术的产生与PAGE胶的发展分不 开。 ➢ 目前测序的方法： ➢ 化学降解法 ➢ 末端终止法 ➢ DNA测序自动化
第一节化学降解法 化学裂解法：是Maxam和Gilberts等人1977年创建 的，该方法是用化学试剂特异性修饰不同碱基，并 在相应碱基处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种 长度的短链（等差数列n=1),经过PAGE和放射 自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 圈 圈 2192
2/92 第一节 化学降解法 化学裂解法：是Maxam和Gilbert等人1977年创建 的，该方法是用化学试剂特异性修饰不同碱基，并 在相应碱基处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种 长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射 自显影后，可以直接读出DNA的顺序
一、基本原理 一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分 别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或 某一类碱基。因此生成4组放射性标记的分子，从共同起 点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。 ■由于每个化学反应体系中，化学试剂对DNA分子上某一 类碱基的降解是随机的，因此，每组混合物中均含有长 短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱 基在原DNA全片段上位置。 此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通 过放射自显影来检测末端标记的分子。 3/92
3/92 一、基本原理 ▪ 一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分 别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或 某一类碱基。因此生成4组放射性标记的分子，从共同起 点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。 ▪ 由于每个化学反应体系中，化学试剂对DNA分子上某一 类碱基的降解是随机的，因此，每组混合物中均含有长 短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱 基在原DNA全片段上位置。 ▪ 此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通 过放射自显影来检测末端标记的分子
化学裂解法测序原理 5'HO-GATCGGACCT 3 单墙放射同位亲标记 〔此例为了一末端标记) 5 PGATOGGACCT 3 下完全修命 锋饰G 修饰G和A 修饰T和C 修饰C 化学裂解 电泳分离 G+A T++C 电 金长核酸 周 "IGATCGGACC 泳 PGATOGGAC C☒ PGATCGGAC 方 POATOGG区四 PGATCG MPGATC G PGAT C] PGA□ PG因 p国 图 口表示被修饰碱基及断裂位世 4/92
4/92 4/95 化学裂解法测序原理
二、基本步骤 1. 限制酶消化待测DNA,得到长度为100-200bp的一组片段，纯化 回收每1个片段作为测序材料。 2. 碱性磷酸酶处理消除5'磷酸。 3. 多核苷酸酶催32 PdNTP:标记(5'-OH)末端。 4. 使标记片段变性为单链。 5. 分成4个反应体系，进行化学处理，严格控制反应条件。（使得平 均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G 反应，则在DNA链上任意位置G断裂。这样，每个反应中虽然都 在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生组不同 长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。 6. 电泳 7. 放射自显影 8. 4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段， 待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出。 5/92
5/92 二、基本步骤 1. 限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化 回收每1个片段作为测序材料。 2. 碱性磷酸酶处理消除5’磷酸。 3. 多核苷酸酶催32PdNTP标记（5’-OH）末端。 4. 使标记片段变性为单链。 5. 分成4个反应体系，进行化学处理，严格控制反应条件。（使得平 均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G 反应，则在DNA链上任意位置G断裂。这样，每个反应中虽然都 在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同 长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。 6. 电泳 7. 放射自显影 8. 4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段， 待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出
5 CGCCGTCATG-3 Label 5'end with 32p 5 32P-CGCCGTCATG3 Cleave Cleave Cleave Cleave atG's atA's&G's atC's&Ts at C's Direction of electrophoresis 3 P-CGCCGTCATG 10 G 9 T A 7 6 T 32P-CGCCG 5 4 c 3 sp -cG} 2 G 1 c Autoradiogram Fragment Deduced length sequence in bases Figure 3-48 The Maxam-Gilbert Chemical Cleavage Method for Sequencing DNA In tbis procedure.four different cbemi cal reagents are employed to cleave single-stranded DNA cbains adjacent to particular bases.The radiouctive fragments are tben separated on the basis of size by gel electropboresis (page 145).wbicb allous the sequential arrangement of bases in the original DNA molecule to be determined.The autoradiogram on the left shows ubat such gels look like.The diagram illus trates the banding pattern that would be observed for a DNA molecule wbose sequence is CGCCGTCATG read in the 53 direction.To belp sbow ubat sucb gel patterns mean,the sequences of tbe tbree fragments produced by the reagent that cleaves adjacent to G residues are provided at the left of tbe diagram
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三、化学修饰试剂 ◆G反应-硫酸二甲酯（DMS)使GN7甲基化，被修饰鸟 嘌呤与核糖的结合下降。 ◆G+A反应-哌啶甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了 腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键， 使DNA发生断裂。 ◆T+C反应-碱性条件下，肼断开了嘧啶环，使DNA断裂。 ◆C反应-在NaCI存在时，只有C才能与肼发生反应。 7/92
7/92 ◆G反应-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，被修饰鸟 嘌呤与核糖的结合下降。 ◆G+A反应-哌啶甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了 腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键， 使DNA发生断裂。 ◆T+C反应-碱性条件下，肼断开了嘧啶环，使DNA断裂。 ◆C反应-在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应。 三、化学修饰试剂
化学试剂及化学反应表 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 G和A C+T 肼 嘧啶开环 C和T 肼（加盐) 胞嘧啶开环 8/92
8/92 化学试剂及化学反应表 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 G和A C+T 肼 嘧啶开环 C和T C 肼（加盐） 胞嘧啶开环 C
四、化学降解法的特点 重现性好，所用试剂简单，易于掌握； 所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个 核苷酸以内的DNA序列效果较好； 序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝； 因此，不会出现误读、可对未克隆的片段、合成的寡核 苷酸直接进行测序； 5和3端均可标记，可从两方向测同一DNA,保证准确 性； ■ 操作繁琐、费时、分辨率较低、试剂毒性大。 9/92
9/92 四、化学降解法的特点 ▪ 重现性好，所用试剂简单，易于掌握； ▪ 所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个 核苷酸以内的DNA序列效果较好； ▪ 序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝； 因此，不会出现误读、可对未克隆的片段、合成的寡核 苷酸直接进行测序； ▪ 5 ′和3 ′端均可标记，可从两方向测同一DNA，保证准确 性； ▪ 操作繁琐、费时、分辨率较低、试剂毒性大
ACGT 5'端标记 试分析其序列 ACCGAAAGACCCAGGATCGCCA 圈 10/92
10/92 A C G T 试分析其序列 ACCGAAAGACCCAGGATCGCCA.GCCC5‘ 5’端标记