第五节重组DNA分子导入大肠杆葡得 DNA分子只有存在话细胞中，生命的特征才展示 大肠杆菌是目前最成熟的受体条统。 >从遗传学的角度来说，遗传物质的转移有转化、转 导、转染和接合等主要的方式 >DNA转入大肠杆菌主要是通过转化来完成。 >噬菌体感染宿主细胞时涉及转导和转染的过程
第五节 重组DNA分子导入大肠杆菌 DNA分子只有存在活细胞中，生命的特征才展示 大肠杆菌是目前最成熟的受体系统。 ➢从遗传学的角度来说，遗传物质的转移有转化、转 导、转染和接合等主要的方式。 ➢ＤＮＡ转入大肠杆菌主要是通过转化来完成。 ➢噬菌体感染宿主细胞时涉及转导和转染的过程
转化(transformation): 和 ■一种细菌菌株由于捕获了外源DNA导致性状特征 发生遗传改变的生命过程。 转化在细菌中是一种善遍的现象。 ■细菌能够从周圆环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态 ■供体DNA与受体细胞特异结合位点结合，达到饱和时开始 摄取外源DNA只有一条DNA单链进入细胞（单链摄入），另一 条链在膜上降解。 ■单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地 掾入到受体DNA中的过程
转化(transformation): ◼一种细菌菌株由于捕获了外源DNA导致性状特征 发生遗传改变的生命过程。 转化在细菌中是一种普遍的现象。 ◼细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态 ◼供体DNA与受体细胞特异结合位点结合，达到饱和时开始 摄取外源DNA只有一条DNA单链进入细胞(单链摄入)，另一 条链在膜上降解。 ◼单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地 掺入到受体DNA中的过程
供体DNA 重组 受体灌 转化体 (6】 Throm 侵人 DNA的级入 分支迁移 修整 连接 错误任复 细菌转化过程图解 (a)供体DNA双链吸附，单链吸入并整合到受体，然后插入： (b)单链供体DNA整合的假说机制
■受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞或寄主细胞host ce)等，从实脸技术上讲是能摄取外源 DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究 价值的细胞。 ●感受态(competence) 细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。 ●感受态细胞(competence cell) 处于能够吸收DNA状态的细胞，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外 源DNA的载体分子通过。 ■转化子(transformant):经转化获得外源遗传物质的细胞
▪ 受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源 DNA并使其稳定维持的细胞;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究 价值的细胞。 ● 感受态(competence) 细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。 ● 感受态细胞(competence cell) 处于能够吸收DNA状态的细胞，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外 源DNA的载体分子通过。 ▪ 转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质的细胞
感受态的建立 >感受态主要受一类蛋白质（感受态因子）影响，感受 态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传 递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。 >一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某 些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为 例，用Ca2+(如CaCl2)处理对数生长后期的大肠杆菌 可以增强其感受能力。 >肺炎双球菌中存在感受态因子、而在大肠杆菌中目 前还未发现明确的遗传因子，但用物理和化学的方 法处理能增强其感受能力
感受态的建立 ➢ 感受态主要受一类蛋白质(感受态因子)影响，感受 态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传 递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。 ➢ 一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某 些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为 例，用Ca2+ (如CaCl2 )处理对数生长后期的大肠杆菌 可以增强其感受能力。 ➢ 肺炎双球菌中存在感受态因子、而在大肠杆菌中目 前还未发现明确的遗传因子，但用物理和化学的方 法处理能增强其感受能力
一、CaC2转化法 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌经过氟化钙适 当处理及短暂热休克之后，便能吸收)噬菌体DNA。 1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氣化钙处理大肠 杆菌细胞也能摄取质粒DNA
一、CaCl2转化法 1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠杆菌经过氯化钙适 当处理及短暂热休克之后,便能吸收λ噬菌体DNA。 1972年美国斯坦福大学 S.Cohen报道,经氯化钙处理大肠 杆菌细胞也能摄取质粒DNA
1、原理 >细菌处于0℃和低渗氯化钙溶液中，菌细胞壁和膜通透性 增如，菌体膨胀成球形，此时转化混合物中DNA形成抗 DNase羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经短暂热休克 (42℃)后，细胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞内。 >在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增 殖，被转化的细菌中，载体中抗生素基因得到表达，在 选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 ●如果感受态细胞做得好，每傲克超螺旋质粒DNA可得 5×107~1×109个转化子
➢ 细菌处于0℃和低渗氯化钙溶液中，菌细胞壁和膜通透性 增加,菌体膨胀成球形，此时转化混合物中DNA形成抗 DNase羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面,经短暂热休克 (42℃)后，细胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞内。 ➢ 在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增 殖，被转化的细菌中，载体中抗生素基因得到表达，在 选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 ● 如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒DNA可得 5×107～1×109个转化子。 1、原 理
获得合格的感受态细胞，要注意以下几点： ①用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在 A600为0.2-0.4左右为好。 ②制备受体细胞的整个过程在0~4℃进行，尽量避免污染。 如果用抗生素筛选转化子，作为对照受体菌应该在此培 养基上不生长。 ③为了提高转化率，可选用复合氟化钙溶液，如FSB溶液
①用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在 A600为0.2-0.4左右为好。 ②制备受体细胞的整个过程在0～4℃进行,尽量避免污染。 如果用抗生素筛选转化子，作为对照受体菌应该在此培 养基上不生长。 ③为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如FSB溶液。 获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：
2、操作步豫 和奏 1)大肠杆菌感受态细胞的制备(CaC2法) (1)从新话化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落， 接种于3~5mlLB液体培养中，37℃振荡培养12h左右， 直至对数生长期。将该菌悬液以1：100~1：50转接于 100mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养 液开始出现混浊后，每隔20~30min测一次0D600nm, 至OD600nm≤0.5时停止培养；
1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) （1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落， 接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右， 直至对数生长期。将该菌悬液以1:100～1:50转接于 100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养 液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm， 至OD600nm≤0.5时停止培养； 2．操作步骤
(2)取培养液转入离心管中，在冰上冷却20-30min,于 4℃，4000r/min离心10min(从这一步开始，所有操作 均在冰上进行，速度尽量快而稳)； (3)倒净上清培养液，用冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液 轻轻悬浮细胞，冰浴； (4)0~4℃，4000r/min离心10min; (5)弃去上清液，加入冰冷的0.1mo1/L CaCI2溶液， 小心悬浮细胞。0~4℃，4000r/min离心10min;
（2）取培养液转入离心管中，在冰上冷却20-30min，于 4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作 均在冰上进行，速度尽量快而稳）； （3）倒净上清培养液，用冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液 轻轻悬浮细胞，冰浴； （4）0～4℃，4000r／min离心10min； （5）弃去上清液，加入冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液， 小心悬浮细胞。0～4℃，4000r／min离心10min；