IPTG Induction IPTG Induction E.coli RNA T7 RNA polymerase polymerase T7 gene 1 Target gene T7 RNA polymerase laco laco lac promoter 7promoter INACTIVE DE3 lac lac repressor repressor PET lac I gene lac I gene T7 lysosyme T7 lysozyme gene E.coli genome HOST CELL > 溶菌酶的高水平表达能有效的抑制T7 RNA POlE的活性，减少 未诱导下目的基因表达。 >Iacl的产物抑制RNA pol,启动下游基因的转录。 2/85
2/85 ➢溶菌酶的高水平表达能有效的抑制T7RNA pol的活性，减少 未诱导下目的基因表达。 ➢lacI的产物抑制RNA pol启动下游基因的转录
第六章大分子的分离与分析 第一节：质粒DNA的提取，碱变性法 第二节：RNA的分离，关键是控制Rnase 第三节：分子杂交 第四节：RNA作图 第五节：转化 3/85
3/85 第六章 大分子的分离与分析 第一节：质粒DNA的提取，碱变性法 第二节：RNA的分离，关键是控制Rnase 第三节：分子杂交 第四节：RNA作图 第五节：转化
第一节DNA的分离、检测和纯化 质粒DNA的小量提取 碱变性法； 煮沸法； 刷 刷 4/85
4/85 质粒DNA的小量提取 第一节 DNA的分离、检测和纯化 碱变性法； 煮沸法；
碱变性法提取质粒的基本原理 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而 共价闭环质粒DNA变性后因拓扑结构纠缠在一起。 ·将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白 质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA复性， 恢复为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染 色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再 冠 用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 5/85
5/85 碱变性法提取质粒的基本原理 ▪ 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而 共价闭环质粒DNA变性后因拓扑结构纠缠在一起。 ▪ 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白 质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA复性， 恢复为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染 色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再 用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA
NaOH是最佳溶解细胞的试剂。 作用： ■使细胞膜发生了从bilayer（双层膜)结构向micelle (微囊)结构的相变化，破坏细胞释放DNA。 ■当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离 而变性。 6/85
6/85 作用: ◼使细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化，破坏细胞释放DNA。 ◼当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离 而变性。 NaOH是最佳溶解细胞的试剂
十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂。 主要作用是： A、溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。 B、解聚细胞中的核蛋白。 C、能与蛋白质结合成为蛋白质复合物，使蛋白质变 性而沉淀下来。 圈 圈 7/85
7/85 主要作用是： A、溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。 B、解聚细胞中的核蛋白。 C、能与蛋白质结合成为蛋白质复合物，使蛋白 质变 性而沉淀下来。 十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂
溶液三的作用 溶液I的K+能置换SDS中的Na+形成了不溶性的PDS。 高浓度的AC-有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以 及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。 刷 8/85
8/85 溶液III的K+能置换SDS中的Na+形成了不溶性的PDS。 高浓度的AC-有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以 及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。 溶液三的作用
葡萄糖的作用： 维持渗透压、增加溶液黏度及防止DNA受机械剪切力 作用而降解。 EDTA Ca和Mg等二价金属离子的螯合剂，抑制Dnase活性。 周 圈 圈 9/85
9/85 维持渗透压、增加溶液黏度及防止DNA受机械剪切力 作用而降解。 葡萄糖的作用： EDTA Ca和Mg等二价金属离子的螯合剂, 抑制Dnase活性
无水乙醇： 乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。 用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的 阳离子，如NaCl和NaAc,其目的是 中和DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力 10/85
10/85 无水乙醇： 乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。 用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的 阳离子，如NaCl和NaAc，其目的是 。 中和DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力
DNA的琼脂糖凝胶电泳原理 凝胶中琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳 定的交联结构。 DNA分子在高于等电点（pl4.2)的PH溶液中带负电荷， 在电场中向正极移动。 移动时电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。 在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶 的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。 11/85
11/85 DNA的琼脂糖凝胶电泳原理 凝胶中琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳 定的交联结构。 DNA分子在高于等电点（pI4.2）的PH溶液中带负电荷， 在电场中向正极移动。 移动时电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。 在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶 的摩擦阻力，即DNA 分子本身的大小和构型