第三章分子克隆载体 引言 (introduction) 第一节质粒载体(plasimid vectors) 第二节入噬菌体载体(phage vectors) 福 第三节单链丝状噬菌体载体 2
2 第三章 分子克隆载体 引 言 （introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 λ噬菌体载体（phage vectors） 第三节 单链丝状噬菌体载体
: 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： 1.能在寄主细胞中进行独立的复制和表达； 2.具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等； 3.具备多克隆位点(MCS),而且可携带外源DNA片段的 长度范围较宽。 4.自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作 和DNA的制备。 3
3 1. 能在寄主细胞中进行独立的复制和表达； 2. 具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等； 3. 具备多克隆位点（MCS），而且可携带外源DNA片段的 长度范围较宽。 4. 自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作 和DNA的制备。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性：
标记基因 选择标记：用于鉴别目标DNA(载体)的存在，将 成功转化了质粒的宿主挑选出来。 筛选标记：用于筛选重组和非重组质粒。 ￥
4 选择标记：用于鉴别目标DNA（载体）的存在，将 成功转化了质粒的宿主挑选出来。 筛选标记：用于筛选重组和非重组质粒。 标记基因
1) 氨苄青霉素抗性基因AmpR ampr ampicil训in 抑菌原理：这类化合物分子结构中有一个B-内酰胺环，能与细 菌细胞膜上的青霉素结合蛋白结合而妨碍细菌细胞壁肽聚糖的 合成，使之不能交联而造成细胞壁的缺损，致使细菌细胞破裂 而死亡。 抗性原理：AmpR编码B-内酰胺酶，可分泌进入细菌的周质区， 水解青霉素的内酰胺环，从而解除了氨苄青霉素的毒性。 盈 5
5 抑菌原理：这类化合物分子结构中有一个-内酰胺环，能与细 菌细胞膜上的青霉素结合蛋白结合而妨碍细菌细胞壁肽聚糖的 合成，使之不能交联而造成细胞壁的缺损，致使细菌细胞破裂 而死亡。 抗性原理：AmpR编码-内酰胺酶，可分泌进入细菌的周质区， 水解青霉素的-内酰胺环，从而解除了氨苄青霉素的毒性。 (1) 氨苄青霉素抗性基因AmpR ampr ampicillin
Ampicillin resistance RP4 Kanamycin Tetracycline resistance resistance 不带有抗菌素抗 性基因的受体菌 E.coli cells, ● ④ some containing RP4 不能在含有抗菌 ○ ⊕cells with plasmid 素的培养基（选 O cells without plasmid 择培养基)中生 长。当带有抗菌 温 素抗性基因的载 体进入受体菌后， ⊙① 受体菌才能生长。 + 厨 ⊕⊕④①⊕ Normal growth Growth medium mediur no antiblotic 6502 湿 All cells Only cells containing can grow RP4 can grow t
6 不带有抗菌素抗 性基因的受体菌 不能在含有抗菌 素的培养基（选 择培养基）中生 长。当带有抗菌 素抗性基因的载 体进入受体菌后， 受体菌才能生长
(1)cu-互补-a complementation LacZ和lacZ基因的互补 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操 纵基因区段的B半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补 是 7
7 (1) -互补- complementation LacZ’ 和lacZ基因的互补 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操 纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补
(LacZ'基因 插入片段 N端序列) (LacZ基因失活) LacZ基因 C端序列 LacZ酶 函 8
8 （LacZ’基因 N端序列） 插入片段 （LacZ’基因失活） LacZ基因 C端序列 LacZ酶
Ecc01092674 BstAPl 179 Aatll 2617 Ndel 183 Sspl 2501 Ehel 235 Pdml 2294 Bcgl 2215 2486 146/ 236/ lacZ MCS Scal 2177 469 pUC18/19 Sapl 683 2686bp 852 Aflll,BspLU111 806 Gs川1784 1626 G10I1779 1466 Ec031l1766 Ea110511694 Tep (pMB1) Cail 1217 9
9 pUC18/19
Ssp I Xmn11937 2142 Aat Il Sca|1818 2260 N Nde l T7↓ 2509 1 start Nar I EcoR I Amp 2561 Sac l 15 Kpn I 1 Ava I 21 Xmal 1 pGEM@-3Z Smal 23 Vector BamH I 6 (2743bp) Xbal 32 Sall 3 AccI 3 Hinc II 40 PstI Sph I 54 Hind II1 6 ↑SP6 69 ori A5:2)1120 T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所 识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶。 10
10 T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所 识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶
f1(+)origin138-444 f1 (+ori B-galactosidase a-fragment 463-816 multiple cloning site 653-760 lac promoter 817-938 ampicillin pUC origin 1158-1825 lacZ ampicillin resistance (bla)ORF 1976-2833 Kpn I pBluescript SK+ MCS 3.0kb -SacI TP lac pBS SK+ pUC ori pBluescript SK(+/-)Multiple Cloning Site Region (sequence shown 601-826) T7 Promoter Kpn I A8d1091 粉o1 TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGT. M13-20 primer binding site T7 primer binding site KS primer binding site. 2tp1061 Hindll EcoRV EcoRI Pl Smal BamH I Spel Xbal .ATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCA. KS primer binding site SK primer binding site T3 Promoter B-gal a-fragment .GCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC T3.prmer binding site M13 Reverse primer binding site
11 pBS SK+