河南师范大学 第6章吸光光度法 教学目的:掌提光度法的基本原理,了解光度分析件的控制,分光光度 法的应用范围。 教学重点:Beer定律:光度分析的应用。 教学难点:光吸收原理;光度分析的准确度。 吸光光度法:基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分折方法,包括比色 法和分光光度法。 分光光度法的优点:灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 6.1概述 6.1.1吸光光度法的特点 1,光的基本性质 紫外光:200-400nm可见光:400-750nm红外:0.75-50um 单色光:单一波长的光。复合光:由不同波长的光组成的光。 互补色光:按一定比例混合,能够组成白光的两种光互称为互补色光。见216。 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色 两互补色按一定比例混合后,可得到白色。 2。吸收光谱产生的原因 由于不同的物质微粒具有不同的量子能级,其能量差也不同,因此物质对光的吸收其有 洗择性。分子能级图,D215.图6一1。 吸收光谱曲线:A~C曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度,在最大吸收波长处 测定吸光度,则灵敏度最高。 a.max与c无关b.Axc 6.1.2光吸收的基本定律 1.朗伯一比尔定律 1760年,Lambert用实验指出,当光通过透明介质时,光的减弱程度与光通过介质的光 程成正比。1852年,Beer研究证明了,光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的 数目成正比,在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。 吸光度:A=lg兰=Kbc透光率:T= 4=lg2=lg月 2.摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 (1)摩尔吸收(光)系数 A=Kbc b:cm c:mol/L A=bc8:摩尔吸收系数,只与波长有关。单位:Lcm.o1 物理音义: 定2下,b=1cm,c=1mol/L时的吸光度 实际工作中不能用c=101/L的溶液测吸光度(A=0.2-0.7)。能反映方法的灵 度,光度法测定8:10,一般e:10己很灵敏。 (2)桑德尔灵敏度指数:S(g/cm) 在m阳x时,A=0.001下,单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含最。 6-1
河南师范大学 第6章 吸光光度法 教学目的:掌握光度法的基本原理,了解光度分析条件的控制,分光光度 法的应用范围。 教学重点:Beer 定律;光度分析的应用。 教学难点:光吸收原理;光度分析的准确度。 吸光光度法:基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法,包括比色 法和分光光度法。 分光光度法的优点:灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 6.1 概述 6.1.1 吸光光度法的特点 1.光的基本性质 紫外光:200-400nm 可见光:400-750nm 红外:0.75-50μm 单色光:单一波长的光。 复合光:由不同波长的光组成的光。 互补色光:按一定比例混合,能够组成白光的两种光互称为互补色光。见 p216。 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色。 两互补色按一定比例混合后,可得到白色。 2.吸收光谱产生的原因 由于不同的物质微粒具有不同的量子能级,其能量差也不同,因此物质对光的吸收具有 选择性。分子能级图,p215,图 6-1。 吸收光谱曲线:A∼C 曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度,在最大吸收波长处 测定吸光度,则灵敏度最高。 a.λmax 与 c 无关 b. A∝c 6.1.2 光吸收的基本定律 1. 朗伯-比尔定律 1760 年,Lambert 用实验指出,当光通过透明介质时,光的减弱程度与光通过介质的光 程成正比。1852 年,Beer 研究证明了,光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的 数目成正比,在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。 吸光度: 0 lg I A Kbc I = = 透光率: 0 I T I = 0 1 lg lg I A I T = = 2.摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 (1)摩尔吸收(光)系数ε A=Kbc b:cm c:mol/L A=εbc ε:摩尔吸收系数,只与波长有关。单位:L.cm-1.mol-1 物理意义:一定λ下,b=1cm,c=1 mol/L 时的吸光度。 实际工作中不能用c=1 mol/L的溶液测吸光度(A=0.2-0.7)。ε能反映方法的灵敏 度,光度法测定ε:104 ,一般ε:105 已很灵敏。 (2)桑德尔灵敏度指数:S (μg/cm2 ) 在λmax 时,A=0.001 下,单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量。 6-1
河南师范大学 S与6的关系:A=0.001=bc,bc=0.001/e Sb(Cm)xc (mo1/ds)xM(/1)10/.001xMx (u/c) K例>e“与邻二氮菲生成红色络合物,=1.1x10, 灵敏度高 Fe与磺基水杨酸络合物,c=5.8x×103, 双硫腙与Pb的6=6.8×10,S=M/6=207/6.8×10-=0.0030(μg/cm) 双硫踪与Cu的e=4.52×10,S=M/e-63.5/4.52x10-0.0014(ug/cm灵敏度高 3.吸光府的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为 A,则总吸光度为 =A+A+.+A (据此可进行多组分的测定) 6.1.3比色法和吸光光度法及其仪器 1.目视比色法:比较透过光的强度 标准色阶:在相同条件下品色,目视比较 特点:灵敏度 准确度低 ,不同人看,结果不同,不符合朗伯一比尔定律也可用目视 比色法 因为比较的是透过光 2.光电比色法:比较溶液对某一波长光的吸收情况。比日视比色法的准确度和选择性好。 3.吸光光度法:与光电比色法的原理相同,只是二者获得单色光的方法不同,前者使用滤光 片,后者使用光栅、棱镜,因而比光电比色法的准确度和选择性好。 4.分光光度计及其基本部件:光源一单色器一比色皿(吸收池)一检测器一显示器 (1)光源钨丝灯:可 、红外400-1000nm氢灯或氘灯:紫外160-350m (2)单色器 a.滤光片:有机玻璃片或薄膜,利用颜色互补原理。 b。棱镜:根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫外、可见 C,光:在玻璃片或金属片上刻划均匀的线,1200条/m 衍射、 干涉原理 (3)吸收泄 玻璃: 可见。 石英:紫外 可 (4)检测器:光电转换器件(光电管、光电倍增光,光电二极管阵列)。利用光电效应,光 照产生光电流,测定光电流的大小。 (5)显示器:检流计:72型。数字显示:722型。数字打印:V一240。 6.2光度分析法的设计 62.1显色反应:将待测组分转化成有色化合物的的反应。M十L=如 1.要求:(1)选择性好:(2)灵敏度高,ε>10:(3)有色化合物L要稳定,不分解: (4)M的组成要一定(只ML无M):(5)ML与L颜色差别大,吸收峰波长差:△>60nm 2.显色剂:满足以上要求。有机显色剂 6.2.2昆色条件的洗摇 1.溶液的酸度 M十L=ML(显色剂L存在酸效应m) a.影响显色剂的溶度 b.影响M的存在状态 c.影响M的组成和稳定性,如Fe艹一磺基水杨酸 pH 组成 颜色 2-3 1:1 紫红 4-8 1:2 棕褐 8-10 1:3 黄色 2.显色剂用量:显色剂过多有时会引起副反应,加入量要严格控制,可通过实验确定。 3.温度:通过实验确定温度范围,通常在室温下进行。 6-2
河南师范大学 S 与ε的关系:A=0.001=εbc,bc=0.001/ε S=b(cm)×c(mol/dm3 )×M(g/mol)×106 μg/g= 3 0.001 10 M M ε ε × × = (μg/cm2 ) Fe2+与邻二氮菲生成红色络合物,ε=1.1×104 , 灵敏度高 Fe2+与磺基水杨酸络合物,ε=5.8×103 , 双硫腙与Pb的ε=6.8×104 ,S=M/ε=207/6.8×104 =0.0030(μg/cm2 ) 双硫腙与Cu的ε=4.52×104 ,S=M/ε=63.5/4.52×104 =0.0014(μg/cm2 ) 灵敏度高 3.吸光度的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为A1,A2,.An,则总吸光度为: A=A1+A2+.+An (据此可进行多组分的测定) 6.1.3 比色法和吸光光度法及其仪器 1.目视比色法:比较透过光的强度 标准色阶:在相同条件下显色,目视比较。 特点:灵敏度高,准确度低,不同人看,结果不同,不符合朗伯-比尔定律也可用目视 比色法,因为比较的是透过光。 2.光电比色法:比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好。 3.吸光光度法:与光电比色法的原理相同,只是二者获得单色光的方法不同,前者使用滤光 片,后者使用光栅、棱镜,因而比光电比色法的准确度和选择性好。 4.分光光度计及其基本部件:光源-单色器-比色皿(吸收池)-检测器-显示器 (1)光源 钨丝灯:可见、红外 400-1000nm 氢灯或氘灯:紫外 160-350nm (2)单色器 a. 滤光片:有机玻璃片或薄膜,利用颜色互补原理。 b. 棱镜:根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫外、可见 c. 光栅:在玻璃片或金属片上刻划均匀的线,1200 条/mm, 衍射、干涉原理 (3)吸收池:玻璃:可见, 石英:紫外、可见 (4)检测器:光电转换器件(光电管、光电倍增光,光电二极管阵列)。利用光电效应,光 照产生光电流,测定光电流的大小。 (5)显示器:检流计:72 型。数字显示:722 型。数字打印:UV-240。 6.2 光度分析法的设计 6.2.1 显色反应:将待测组分转化成有色化合物的的反应。M+L=ML 1.要求:(1)选择性好;(2)灵敏度高,ε>104 ;(3)有色化合物ML要稳定,不分解; (4)ML 的组成要一定(只 ML 无 MLn);(5)ML 与 L 颜色差别大,吸收峰波长差:Δλ>60nm. 2.显色剂:满足以上要求。有机显色剂 6.2.2 显色条件的选择 1.溶液的酸度:M+L=ML(显色剂L存在酸效应αL(H)) a. 影响显色剂的溶度 b. 影响 M 的存在状态 c. 影响ML的组成和稳定性,如Fe3+-磺基水杨酸 pH 组成 颜色 2-3 1:1 紫红 4-8 1:2 棕褐 8-10 1:3 黄色 2.显色剂用量:显色剂过多有时会引起副反应,加入量要严格控制,可通过实验确定。 3.温度:通过实验确定温度范围,通常在室温下进行。 6-2
河南师范大学 4.溶剂:一般鳌合物在有机溶剂中溶解度大,提高显色反应的灵敏度。如Cu(SC)”在水中 大部分离解,几乎无色:在丙酮中呈蓝色。 5.显色时间:通过实验找出适宜的显色时 6。干扰组分:共存组分与显色剂生成有色络合物,正干扰:生成无色络合物,负干扰 干扰的消除: (1)制一定酸度,使干扰组分不生色。 (2)拖蔽剂,与干扰组分生成无色物 3) 洗择活当的被长 (4) 选择适当的参比液 (5) 分离干扰组分 6.2.3测量波长和吸光度范围的选择 1.测量波长的选择 (1)“最大吸收原则:选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。无干扰)2)吸收最大, 扰最小”:在最大波长处有其他物质干扰时。如图6 2.吸光度范围的选择:A:0.2-0.8(T为65%-15%)(相对误差较小) 6.2.4参比溶液的选择 1.M、L均无色,可用蒸馏水作参比。 2.L无伍,M有色,可用不加昆鱼剂的被测试液作参出溶液 3.L有色,M无色, 可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液 4.L、M均有色,可将一份试液加入适当掩蔽剂,将被测组分掩蔽起来,使之不再与显色 剂作用,而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入,以此作为参比溶液。 5.改变加入试剂的顺序,使被测组分不发生显色反应,可以此溶液作为参比溶液消除于扰。 6.2.5标准曲线的制作 配制一系列标准溶液,作A一曲线,待测组分的含量可以从标准曲线上查出 63 光度分析法的误差 6.3.1对朗伯-比尔定律的偏 1.非单色光 d==,I=10-ok lot =c:be=lg,=10-9k A按电 I+Io 若G=,则A=6bC,若6≠,A与c不成线性关系 2.介质不均匀引起的偏离 3.由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 6.3.2吸光度测量的误差 光度分析的准确度,由仪器本身决定的,对一台仪器来说读数误差△T为定值 定的△,对应的△c不同,相对误差△c/c不同。 c小,△1起的△c小,△c/c大:c大,△起的△c大,△c/c大。 AlgT-0,434nTdA=0434drh-0434T-0434d T A TU-lgT)TUgT 6-3
河南师范大学 4.溶剂:一般螯合物在有机溶剂中溶解度大,提高显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)4 2-在水中 大部分离解,几乎无色;在丙酮中呈蓝色。 5.显色时间:通过实验找出适宜的显色时间。 6.干扰组分:共存组分与显色剂生成有色络合物,正干扰;生成无色络合物,负干扰。 干扰的消除: (1) 制一定酸度,使干扰组分不生色。 (2) 掩蔽剂,与干扰组分生成无色物。 (3) 选择适当的波长。 (4) 选择适当的参比液 (5) 分离干扰组分 6.2.3 测量波长和吸光度范围的选择 1.测量波长的选择 (1)“最大吸收原则”:选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰)(2)”吸收最大, 干扰最小”:在最大波长处有其他物质干扰时。如图 6-7 2. 吸光度范围的选择:A:0.2-0.8(T 为 65%-15%)(相对误差较小) 6.2.4 参比溶液的选择 1.M、L 均无色,可用蒸馏水作参比。 2. L 无色,M 有色,可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。 3. L 有色,M 无色,可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。 4.L、M 均有色,可将一份试液加入适当掩蔽剂,将被测组分掩蔽起来,使之不再与显色 剂作用,而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入,以此作为参比溶液。 5.改变加入试剂的顺序,使被测组分不发生显色反应,可以此溶液作为参比溶液消除于扰。 6.2.5 标准曲线的制作 配制一系列标准溶液,作 A-c 曲线,待测组分的含量可以从标准曲线上查出。 6.3 光度分析法的误差 6.3.1 对朗伯-比尔定律的偏离 1.非单色光 1 2 1 2 01 02 1 1 01 2 2 2 02 1 2 01 02 01 02 1 2 01 02 lg , 10 lg , 10 A lg lg A A c 10 10 bc bc bc bc I I A bc I I A bc I I I I II II II I I ε ε ε ε ε ε εε ε ε ε − − − − == = == = 1 2 1 2 ≠ + + = = 若 = ,则 = bc,若 , 与 不成线性关系 + + 2.介质不均匀引起的偏离 3.由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 6.3.2 吸光度测量的误差 光度分析的准确度,由仪器本身决定的,对一台仪器来说读数误差ΔT 为定值。 一定的ΔT,对应的Δc不同,相对误差Δc/c不同。 c小,ΔT引起的Δc小,Δc/c大;c大,ΔT引起的Δc大,Δc/c大。 0.434dT dA 0.434dT 0.434dT A=-lgT=0.434lnT dA=- =- = T A T (-lgT) T lgT 相对误差: 0.434 lg c A dA dT RE c A A TT Δ Δ == == 6-3
河南师范大学 6.4其他吸光光度法和光度分析法的应用 6.4.1示差吸光光度法 1.原理(高浓度示差吸光光度法) 选用比cx浓度稍小的c为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。 么=EC8到=4m=AM=4-4=b6-6)=6bac=6cw定量基瑞:AM=6b(化-6)=6bac a.先做△A-Ac标准曲线:b.测待测溶液的△A:c.从标准曲线查出相应的△c:d.cx=cO+△c 设普通光度法和示差光度法的测量误差为x%普通光度法结果:G,±C,·x%,示差光度法结 果:c±(c-a)% 6.4.2双波长吸光光度法 1.原理:当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法;广泛运用于环境试样和生物 试样的分析 2.应用:(1)混浊试液中组分的测定:(2)单组分的测定:(3)两组分共存时的分别测定。 6.4.3酸(碱)离解常数的测定 HB H*+B 在某波长入下,测量溶液吸光度(设酸HB和碱B均有吸收,液层厚度b=1cm)则 cw[H:】 A=HB]+s[B]=eK,+H问sK,+H阿 AHw=EHBC,Ag=Erc→pK。=plH-lg (A-A-) 6.4.4络合物组成的测定 (1)饱和法(又称摩尔比法) (2)连续变化法(又称等摩尔系列法) 固定一种组分(通常是金 CMCRFC,改变cM和cR的相对量, 属离子M0的浓度,改变络合 配制一系列溶液,在有色络合物 剂(®)的浓度,得到一系列 的最大吸收波长处测量这一系列 [R]/0比值不同的溶液, 溶液的吸光度。当溶液中络合物 并配制相应的试剂空白作 Rn浓度最大时,cRcW比值为n。 参比液,分别测定其吸光度。 当cc为0.5时,络合比为1:1: 以吸光度A为纵坐标,[R]/M)为横坐标作图 当cc为0.33,络合比为1:2 0.5 0.4 8 0.1 [RVIM) "m848888 0.0 图6一16饱和法 图6一17生续变化法 作业:P3,5,6Pa98,11,12P2015,17,19 6-4
河南师范大学 6.4 其他吸光光度法和光度分析法的应用 6.4.1示差吸光光度法 1.原理(高浓度示差吸光光度法) 选用比cx浓度稍小的c0为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。 } 0 0 ( ) ( ) 0 0 0 , x x x x x A cb A A A A b c c b c bc A bc c bc A cb ε ε εε ε ε = ⇒ = Δ = − = − == Δ = Δ= − = Δ = 相对 相对 定量基础: ε x a.先做ΔA~Δc 标准曲线;b.测待测溶液的ΔA;c.从标准曲线查出相应的Δc;d.cx=c0+ Δc 设普通光度法和示差光度法的测量误差为 x%普通光度法结果:c c x x ± ⋅ % ±−⋅ c x ,示差光度法结 果:c c x x ( ) 0 % 6.4.2 双波长吸光光度法 1.原理:当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法;广泛运用于环境试样和生物 试样的分析 2.应用:(1)混浊试液中组分的测定;(2)单组分的测定;(3)两组分共存时的分别测定。 6.4.3 酸(碱)离解常数的测定 HB = H+ + B- 在某波长λ下,测量溶液吸光度(设酸HB和碱B- 均有吸收,液层厚度b=1cm)则 [ ] [] [ ] [ ] [ ] ( ) ( ) , l HB HB a HB B B HB a a HB HB HB B B a B c H c K A HB B KH KH A A A c A c pK pH A A ε εε ε ε ε − − − − − + − + + = += + + + − = = ⇒ =− − g 6.4.4 络合物组成的测定 (1)饱和法(又称摩尔比法) (2)连续变化法(又称等摩尔系列法) 固定一种组分(通常是金 cM+cR=c,改变 cM和 cR 的相对量, 属离子 M)的浓度,改变络合 配制一系列溶液,在有色络合物 剂(R)的浓度,得到一系列 的最大吸收波长处测量这一系列 [R]/[M]比值不同的溶液, 溶液的吸光度。当溶液中络合物 并配制相应的试剂空白作 MRn 浓度最大时,cR/cM 比值为 n。 参比液,分别测定其吸光度。 当 cM/c 为 0.5 时,络合比为 1:1; 以吸光度 A 为纵坐标,[R]/[M]为横坐标作图。 当 cM/c 为 0.33,络合比为 1:2; 作业:P238 3, 5, 6 P239 8, 11, 12 P240 15, 17, 19 6-4