版权所有·禁止翻制、电子传 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1479-2004 进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法 Inspection of malachite green residues in aquatic products for import and export 2004-11-17发布 2005-04-01实施 曲家旒量年传检总胃 发布
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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发昏 SN/T1479-2004 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国上海出人境检验检疫局负贵起草 本标准主要起草人：郭德华、叶长淋、李波，朱畅。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准
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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发鲁 SN/T1479-2004 进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法 1范固 本标准规定了进出口水产品中孔雀石绿残留量的抽样、制样和液相色谱测定方法。 本标准适用于进出口鱼，虾、贝，蟹中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的检验 2抽样和制样 2.1检验批 以不超过10000箱为一检验批。 同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。 2.2抽样数量 抽样数量见表1。 表1抽样数量 批量/件 最低抽样数/件 冷冻品 活品，盐藏岛 150及以下 90及以下 3 1513200 91500 3201-10000 501-1200 13 1201-10000 20 2.3抽样方法 按2.2规定的抽样件数随机抽取，逐件开启，从每件中抽取500g为原始样品，原始样品总量不少 于4kg,放入清洁容器内，加封后，标明标记及时送交实验室。 2.4试样制备 从抽取的原始样品中取可食部分，放入高速组织捣碎机中捣碎均匀。将捣碎的样品充分混匀，分出 约500g,作为试样，装入清洁容器中，标明标记。 2. 试样保存 将试样于一18℃以下冷冻保存。 2.6警示 在抽样和制样过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 3测定方法 3.1方法提要 试样中的残留物用乙睛-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烧层，最后用 丙磺酸固相提取小柱净化，洗脱液用C、液相色谱柱和PbO,柱后衍生柱在可见光处测定，外标法定 量。如有必要可用液相色谱质谱/质谱法确证。 3.2试剂和材料 除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。 3.2.1乙腈：液相色谱纯
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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发昏 SN/T1479-2004 3.2.2二氯甲烷。 3.2.3甲醇：液相色谱纯 3.2.4醋酸盐缓冲液：溶解4.95g无水乙酸钠及0.95g一水对甲苯磺酸于900mL水中，用冰醋酸调 节溶液pH到4.5，最后用水稀释到1L 3.2.520%(质量分数)盐酸羟胺水溶液：溶解12.5g盐酸羟胺在50mL水中。 3.2.60.2%盐酸羟胺甲酵溶液：准确移取1mL20%盐酸羟胺水溶液到100mL容量瓶，用甲醇准确 定容至刻度线。 3.2.71.0mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2g一水对-甲苯磺酸，并用水稀释至100mL 3.2.8 二甘 3.2.9酸性氧化铝：80日~120日. 3.2.10二氧化铅。 3.2.11硅藻土：色谱层析级 3.2.12孔雀石绿标准品：纯度>98% 3.2.13孔雀石绿标准溶液：准确称取适量的孔爸石绿标准品，用甲醇配成浓度为1mg/mL的标准储 备液。 3.2.14隐色孔雀石绿标准品：纯度>98%. 3.2.15隐色孔雀石绿标准溶液：准确称取适量的隐色孔雀石绿标准品，用甲醇配成浓度为1mg/mL 的作他气产经和隐色孔在石经际准在游流准确体通上迷两种标准能备流用甲尼取浓吸 为10g/mL的标准混合液。 3.3仪器和设备 33.1高效液相色谱仪：配有紫外可见光检测器。 3.3.2 高效液相色谱质谱/质谱仪。 3.33 高速均质器 3.3.4离心机：3000r/min。 3.3,5闹相萃取装堂。 3.3.625%P0。每化柱，空的不锈铜预柱管，3cm×4mm(内径)，两端覆以2um的过滤板，在轴直空 的情况下，把含有25%PbO,的Cite硅胶装柱，添加数滴甲醇后压实后旋紧。临用前用甲冲洗。将 PbO,氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间 3.3.7丙磺酸(RRS SPE)固相萃取小柱：500mg,Bond E1 ut LRC,或相当者。 3.3,8中性氧化铝固相茶取小柱：lg,Supeclean LC-alumina-N,或相当者。 3.3.9离心、管，50mL,100m,且寒。 34 测定步聚 3.4.1 提取 淮确称取5.0g样品于50mL离心管内，加人1.5mL20%的盐酸羟胺水溶液、2.5mL1.0mol/L 的对甲米磺酸溶液，5,0mL乙酸盐缓冲溶液，用均质机以15000r/min的速度均质30s,加人10ml 乙腈后剧烈震摇30s。再加人10g酸性氧化铝，再次震30s。将离心管置于离心机内以3000/m 的速度离心10 min。 把上清液转移至装 有0 mL水和2mL 甘醇的100mL离心管中。然后在 50mL离心管中加入10mL乙腈，重复上述操作，将上清液转移至同一100mL离心管中。 3.4.2净化 在离心管中加人15mL二氯甲烷，振荡10s后，置于离心机内以3000r/min的速度离心10min 用尖嘴移液管将下层溶液转移至100mL的梨形烧瓶中，再用10mL二氯甲烷重复上述操作一次，合并 氯甲烷层于同一梨形烧瓶中 。于45℃旋转蒸发至约1mL,用5mL乙腩溶解残渣
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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售 SN/T1479-2004 将PRS固相萃取小柱安装在固相萃取装置上，PRS小柱上端再连接中性氧化铝固相萃取小柱，用 5L乙腈活化小柱，把烧瓶中的溶液转移到小柱上，在抽真空情况下过柱，再用乙腈洗涤烧瓶两次，每 次2.5mL,把洗涤液依次通过柱，弃去中性氧化铝小柱。在不拍真空的情况下，依次准确用1mL流动 相、lmL流动相和1mL盐酸羟胺甲 液洗脱PRS柱，把洗脱液收集到5mL刻度试管中，用流动市 稀释至3mL,过0.454m微孔滤膜，滤液供液相色谱测定。 3.4.3标准工作液的配置 根据需要，准确移取适量标准混合液于5mL刻度试管中，放在40℃加热板上用氮气流吹干，准确 加人1mL盐酸羟胺甲溶液，用流动相稀释至3mL,混匀。 3.4.4测定 3.4.4.1 液相色谱条竹 a)色谱柱：氰基柱，150mm×4.6mm(内径)，填充物粒度10m,或相当者，在氰基色谱柱和检 测器之间连接25%Pb02氧化柱， b)流动相：乙腈-乙藏盐缓冲液(55+45)： c）流速：2.0ml/min d)柱温：室温 e)检测波长：618nm: )进样量：50L 3.4.4.2色谱测定 根据样液中被剥孔雀石绿或隐色孔石绿含量情况选定峰高相近的标准工作溶液，标准工作 液和样液中孔雀石绿或隐色孔雀石绿响应值均应在仪器检测线性范围内。对标淮工作溶液和样液等体 积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石绿和隐色孔雀石绿的保留时间约为5,8mi和2.8min, 标准品色普图参见附录A中图A.1。 3.45确正 3.4.5.1 液相色谱-质谱/质谱条件 a) 色谱柱：0DS,250mm×2.0mm,或相当者，在色谱柱和检测器之间连接25%Pb0,氧化柱； b)流动相：0.05mol/L乙酸铵(pH4.5)-乙腈(25+75)： c)流速：0.2mL/min d)柱温：室温： e) 进样量：50L: D 电离方式：ES+: g)毛细管电压：2.9kV h)锥体电压.55V: 离子源温度：120℃ 干燥温度：350℃ k)雾化气流量：90L/Hr: 1)干操气流量：490L/1Hr m)张撞能量，30eV: n)测定方式：TOF; 母离子(m/x):329,碎片离子(m/):313,208 3.4.5.2液相色谱-质谱/质谱确证 对3.4.2和3.4.3中最后所得的样液及标准液，用2mL二氯甲烷提取，移取二氯甲烷层并挥干，准确 加入1,0mL流动相以溶解残渣，按3.4,5.1规定的条件进行测定。如果样液中与标准溶液相同的保留时 间有监测离子峰出现，则对其进行质谱确证。标准品的质谱图见附录B中图B1、图B2、图B.3。 3
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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发昏 SN/T1479-2004 3.4.6空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行 3.4.7结果计算和表述 3.4.7.1 结果计 用色谱数据处理机或按式(1)计算样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿残留含量 .(1) 式中： X一样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿含量，单位为微克每千克(g/kg): 孔雀石绿标准工作液或隐色孔雀石绿标准工作液的质量，单位为纳克(g): 6、 样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿的峰高，单位为毫米(mm) H 孔雀石绿标准工作液或隐色孔雀石绿标准工作液的峰高，单位为毫米(mm): 试样量，单位为克(g). 注：计算结果需扣除空白值。 3.4.7.2测定结果的表述 本检验方法的残韶量测定结果系指孔雀石绿和它的代物喷鱼孔雀石绿残留量的之和，以孔雀石 绿表示 4测定低限、回收率 4.1测定低限 本方法中采用HPLC-VIS法孔雀石绿的测定低限为2ug/kg 本方法中采用HPLC-MS/MS法孔雀石绿的测定低限为 1 gg/kg. 本方法中采用HPLC-VIS法孔雀石绿的测定低限为2g/g。 本方法中采用HPLC-MS/MS法孔雀石绿的测定低限为1g/kg 4.2回收奉 鳗鱼中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿的添加浓度及其回收率的HPLC-VIS实验数据， 在2g/kg时，孔雀石绿的回 收率为85.5%，隐色孔雀石绿的回收率为87.0% 在25g/kg时，孔金石绿的回收率为90.0%，隐色孔雀石绿的回收率为88.0% 在200g/kg时，孔雀石绿的回收率为87.0%，隐色孔雀石绿的回收率为88.5%
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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售 SN/T1479-2004 附录A (资料性附录) 标准品色谱图 德色孔石 10.00 图A1孔雀石绿及隐色孔雀石绿标准品的液相色谱图
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版权所有●禁止翻制、电子传阅、发鲁 SN/T1479-2004 标准品质谱图 100 14.05 .94 6020408o0a0"m007z07016018002a0 注：孔雀石绿保留时间：2.94min,隐色孔雀石绿保留时向：14.05min。 图B.1孔雀石绿及隐色孔雀石绿标准品的总离子流图 1001 32929 31,03925 208.14 313 20813 42,37165102081 41,12270.1728519 3024 47,98490.58 图B.2孔雀石绿标准品的质谱图
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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发鲁 SN/T1479-2004 100 328424 3132 165.08193.13 96的1oi的di22d点b如o的0的o4o40oo品2 图B.3隐色孔雀石绿标准品的质谱图
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版权所有●禁止翻制、电子传阅、发鲁 SN/T1479-2004 Foreword Annex A and annex B of this standard is an informative annex. This standard was proposed byand isnder the charge of the Certification and istration of the People's Republic of China. This standard was drafted by Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People's Republic of China. The main drafters of this standard are Guo dehua,Ye Changlin,Li Bo and Zhu Chang. This standard is a professional standard promulgated for the first time. Note:this English versionraifrom the Chinese text.is solely for guidnce
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