实验五药敏实验
实验五 药敏实验
一实验目的1、掌握细菌纯化再培养的方法2、掌握人工药敏实验方法2
2 一、实验目的 1、掌握细菌纯化再培养的方法 2、掌握人工药敏实验方法
药敏试验常用方法1.纸片扩散法（DiskDiffusion Test）Kirby-Bauer法（K-B纸片琼脂扩散法）和直接纸片药敏法2.稀释法（Dilution Test）：包括琼脂稀释法（药物混合在培养基中）和肉汤稀释法（抗生素梯度稀释）3.抗生素浓度梯度法-E试验（E-test）3
3 二、药敏试验常用方法 1. 纸片扩散法（Disk Diffusion Test）： Kirby-Bauer法（K-B纸片琼脂扩散法） 和直接纸片药敏法 2. 稀释法（Dilution Test）： 包括琼脂稀释法（药物混合在培养基中） 和肉汤稀释法（抗生素梯度稀释） 3. 抗生素浓度梯度法-E 试 验（E-test）
实验原理将含有一定量抗菌药物的纸片或药片平贴于已接种被检细菌的琼脂培养基上，纸片或药片中的药物即呈梯度向周围扩散，敏感菌株在纸片或药片的周围生长受到抑制，而形成抑菌圈。根据抑菌圈的大小，可判断细菌对抗菌药物的敏感性4
4 二、实验原理 将含有一定量抗菌药物的纸片或药片， 平贴于已接种被检细菌的琼脂培养基上，纸 片或药片中的药物即呈梯度向周围扩散，敏 感菌株在纸片或药片的周围生长受到抑制， 而形成抑菌圈。根据抑菌圈的大小，可判断 细菌对抗菌药物的敏感性
影响药敏结果的因素一、培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，且培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子。二、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小。三、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。四、培养时间：一般在37℃下培养18-24小时
影响药敏结果的因素 一、培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注 平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，且培养基 内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子。 二、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈 变小。 三、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的 结果，需精确配制。 四、培养时间：一般在37℃下培养18-24小时
三、实验材料与器材1、实验材料分离培养的细菌、平板，药敏纸片2、实验器材超净工作台、分光光度计、量尺或游标卡尺6
6 三、实验材料与器材 1、实验材料 分离培养的细菌、平板，药敏纸片 2、实验器材 超净工作台、分光光度计、量尺或游标卡尺
四、实验内容与步骤（一）倒平板：固体培养基的准备（二）细菌纯培养及菌悬液的制备确定细菌的浓度：将细菌离心沉淀后用无菌PBS稀释至OD值为0.2左右（细菌OD600吸光度在0.2-1.5范围内，细菌数与OD值呈线性相关，OD值为0.2的细菌数约为1*108CFU/mL）。7
7 四、实验内容与步骤 （一）倒平板：固体培养基的准备 （二）细菌纯培养及菌悬液的制备 确定细菌的浓度：将细菌离心沉淀后用无菌PBS 稀释至OD值为0.2左右（细菌OD600吸光度在0.2-1.5 范围内，细菌数与OD值呈线性相关，OD值为0.2的 细菌数约为1*108 CFU/mL）
四、实验内容与步骤（二）药物敏感试验（纸片琼脂扩散法）①取100-200ul菌液均匀涂布平板：②用无菌镊子将纸片贴于含菌琼脂表面，每面贴3~4个纸片，放置15分钟。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片③倒置在28℃培养箱中培养24h观察结果④用尺量包括纸片直径在内的抑菌环最大直径，判定结果（敏感、中度敏感、耐药）。8
8 四、实验内容与步骤 （二）药物敏感试验（纸片琼脂扩散法） ① 取100-200μl菌液均匀涂布平板； ②用无菌镊子将纸片贴于含菌琼脂表面，每面贴 3~4个纸片，放置15分钟。为了使药敏片与培养基紧密 相贴，可用镊子轻按几下药敏片。 ③倒置在28℃培养箱中培养24h观察结果。 ④用尺量包括纸片直径在内的抑菌环最大直径，判 定结果（敏感、中度敏感、耐药）
(a)(b)(c)(d)(e)(f)图3-54Kirby-Bauer法试验程序（a）挑取菌落（b）转种肉汤（c）比油（d）涂布平板上（e）放置药敏纸片（f）量取抑菌圈大小
药物敏感实验判定标准抑菌圈直径 (毫米）敏感度极敏20以上高敏15-20中敏10-14低敏10以下0不敏*具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准
抑菌圈直径（毫米） 敏感度 20以上 极敏 15-20 高敏 10-14 中敏 10以下 低敏 0 不敏 药物敏感实验判定标准 * 具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸 片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准