第8章 层析分离 ▪ 知识点：色层分离法的分类及其概念，柱层析技术，吸 附层析技术，离交层析技术，生物亲和层析技术，分配 层析技术，凝胶过滤技术，电泳技术，薄板层析技术。 ▪ 重点：上述各技术的原理、操作方式、操作过程、所用 装置和材料的选择、适用范围，能够灵活熟练地运用这 些技术。 ▪ 难点：常用层析法的分类及其合理选用
第8章 层析分离 ▪ 知识点：色层分离法的分类及其概念，柱层析技术，吸 附层析技术，离交层析技术，生物亲和层析技术，分配 层析技术，凝胶过滤技术，电泳技术，薄板层析技术。 ▪ 重点：上述各技术的原理、操作方式、操作过程、所用 装置和材料的选择、适用范围，能够灵活熟练地运用这 些技术。 ▪ 难点：常用层析法的分类及其合理选用
目 录 ▪ 1 层析法概述 ▪ 2 柱层析 ▪ 3 纸层析 ▪ 4 薄层层析 ▪ 5 吸附层析 ▪ 6 分配层析 ▪ 7 凝胶过滤 ▪ 8 电泳法 ▪ 9 毛细管电泳 ▪ 10高效液相色谱
目 录 ▪ 1 层析法概述 ▪ 2 柱层析 ▪ 3 纸层析 ▪ 4 薄层层析 ▪ 5 吸附层析 ▪ 6 分配层析 ▪ 7 凝胶过滤 ▪ 8 电泳法 ▪ 9 毛细管电泳 ▪ 10高效液相色谱
1 层析法概述 1.1 引言 1.2 层析的发展史 1.3 层析的基本原理及基本概念 1.4 层析的分类 1.5 层析剂
1 层析法概述 1.1 引言 1.2 层析的发展史 1.3 层析的基本原理及基本概念 1.4 层析的分类 1.5 层析剂
1.1 引言 层析原理 色谱（层析）法应用范围 色谱技术的提出
1.1 引言 层析原理 色谱（层析）法应用范围 色谱技术的提出
色谱分离图示
色谱分离图示
(a) (b) (c) (d) e ●成分 移勤相 ☐成分2 D ◇成分的 固定相 成分1 .060 ▲成分 . 000 0000 。成分5 000 .o."o 0 000 D 000g 益 是 超
1.2 层析的发展史 年代 发明者 发明的色谱方法或重要应用 1906 Tswett 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念 1931 Kuhn, Lederer 用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始 为人们所重视。 1938 Taylor Uray 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 1941 Martin, Synge 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作 为流动相（即气相色谱）。 1952 Martin, James 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 1956 Van Deemter 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。 1957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958 Golay 发明毛细管柱气相色谱。 1965 Giddings 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 1975 Small 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑 制型电导检测的新型离子色谱法。 1981 Jorgenson 创立了毛细管电泳法
1.2 层析的发展史 年代 发明者 发明的色谱方法或重要应用 1906 Tswett 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念 1931 Kuhn, Lederer 用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始 为人们所重视。 1938 Taylor Uray 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 1941 Martin, Synge 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作 为流动相（即气相色谱）。 1952 Martin, James 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 1956 Van Deemter 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。 1957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958 Golay 发明毛细管柱气相色谱。 1965 Giddings 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 1975 Small 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑 制型电导检测的新型离子色谱法。 1981 Jorgenson 创立了毛细管电泳法
1.3 层析基本概念 ▪ 层析 ▪ 展开（development） ▪ 洗脱液(eluate) ▪ 色谱(Chromatograph)。 ▪ 分配系数 ▪ 洗脱体积： ▪ 外体积： ▪ 内体积 ： ▪ 正相层析： ▪ 反相层析：
1.3 层析基本概念 ▪ 层析 ▪ 展开（development） ▪ 洗脱液(eluate) ▪ 色谱(Chromatograph)。 ▪ 分配系数 ▪ 洗脱体积： ▪ 外体积： ▪ 内体积 ： ▪ 正相层析： ▪ 反相层析：
1.4 层析分类 分类原则 类型 特征 据溶质分子与固定 相相互作用的机理 不同 吸附色谱 离子交换色谱 疏水作用层 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配色谱 凝胶过滤 亲和色谱 吸附力不同 各物质与固定相之间的离子交换能力的不同 各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同 各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同 巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同 各物质在两液相间的分配系数不同 各物质的分子大小或形状不同 利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同 据实验技术 低压色谱 中压色谱 高压色谱 电泳 操作压力小于0.5 MPa 操作压力在0.5～5 MPa之间 操作压力在5～40 MPa之间 溶质分子在电场中的移动速度不同 据固定相的形状不 同 柱色谱 纸色谱 薄层色谱 固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中 固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水 固定相在玻璃平板上铺成薄层 据流动相的物态不 同 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱 流动相为气体 流动相为液态 流动相为液态 按操作方式不同 迎头法 顶替法 洗脱法 将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流 出，但其它各组分都不能达到分离。 利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。 此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。 将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱 溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂
1.4 层析分类 分类原则 类型 特征 据溶质分子与固定 相相互作用的机理 不同 吸附色谱 离子交换色谱 疏水作用层 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配色谱 凝胶过滤 亲和色谱 吸附力不同 各物质与固定相之间的离子交换能力的不同 各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同 各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同 巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同 各物质在两液相间的分配系数不同 各物质的分子大小或形状不同 利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同 据实验技术 低压色谱 中压色谱 高压色谱 电泳 操作压力小于0.5 MPa 操作压力在0.5～5 MPa之间 操作压力在5～40 MPa之间 溶质分子在电场中的移动速度不同 据固定相的形状不 同 柱色谱 纸色谱 薄层色谱 固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中 固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水 固定相在玻璃平板上铺成薄层 据流动相的物态不 同 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱 流动相为气体 流动相为液态 流动相为液态 按操作方式不同 迎头法 顶替法 洗脱法 将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流 出，但其它各组分都不能达到分离。 利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。 此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。 将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱 溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂
吸附色谱与其它色谱法的异同点 类型 机理 优点 缺点 适用范围 吸附色谱 化学、物理吸附 操作简便 易受离子干 扰 各种生物大分 子的分离、脱 色、和去热源 凝胶过滤 分子筛的排阻效应 分辨力高，不 会引起变性 各种凝胶介 质昂贵，处 理量有限制 分子量有明显 差别的可溶性 生物大分子 分配色谱 溶质在固定相和流 动相中分配系数的 差异 分辨力高，重 复性较好，能 分离微量物质 影响因子多， 上样量太小 用于各种生物 大分子的分析 鉴定 亲和色谱 亲和色谱生物大分 子与配体之间有特 殊亲和力 分辨力很高 一种配体只 能用于一种 生物大分子， 局限性大 各种生物大分 子 聚焦色谱 等电点和离子交换 作用 分辨力高 进口试制昂 贵 蛋白质和酶
吸附色谱与其它色谱法的异同点 类型 机理 优点 缺点 适用范围 吸附色谱 化学、物理吸附 操作简便 易受离子干 扰 各种生物大分 子的分离、脱 色、和去热源 凝胶过滤 分子筛的排阻效应 分辨力高，不 会引起变性 各种凝胶介 质昂贵，处 理量有限制 分子量有明显 差别的可溶性 生物大分子 分配色谱 溶质在固定相和流 动相中分配系数的 差异 分辨力高，重 复性较好，能 分离微量物质 影响因子多， 上样量太小 用于各种生物 大分子的分析 鉴定 亲和色谱 亲和色谱生物大分 子与配体之间有特 殊亲和力 分辨力很高 一种配体只 能用于一种 生物大分子， 局限性大 各种生物大分 子 聚焦色谱 等电点和离子交换 作用 分辨力高 进口试制昂 贵 蛋白质和酶