基因操作 第一节重组DNA技术 Cel Re5tt9a5C3gn沿e (recombinant DNA → technique) Nucleus STEP 1:A restriction enzyme is used to cut a specific DNA strand DNA克隆(DNA cloning) from the DNA of a cell. Original DNA Strand DNA Ligase 分子杂交(molecular hybridization) Viral DNA Virus
基因操作 第一节重组DNA技术 (recombinant DNA technique) •DNA克隆 (DNA cloning) •分子杂交(molecular hybridization)
(一)限制性内切核酸酶Restrictionenzymes 限制性内切核酸酶又称限制酶。限制酶是从核酸分子内部切割（水 解断裂)磷酸二醋键生成DNA片段的一种内切酶。 EcoR 1 from E.coli GAATTC PALINDROME AAGCTT Hind IⅡfom coak Haemophilus influenza
(一)限制性内切核酸酶Restriction enzymes 限制性内切核酸酶又称限制酶。限制酶是从核酸分子内部切割(水 解断裂)磷酸二醋键生成DNA片段的一种内切酶。 EcoR 1 from E.coli G A A T T C C T T A A G PALINDROME A A G C T T Hind III from T T C G A A Haemophilus influenza
Action of Restriction enzymes (Form restriction fragments) EcoR 1 from E.coli GAATTC A AATTC CTTAA G Sticky ends
Action of Restriction enzymes (Form restriction fragments) EcoR 1 from E.coli G A A T T C C T T A A G A A T T C C T T A A G G Sticky ends
Haellli酶的识别序列： 5--GG 'CC--3 3'--CC↑GG--5 酶切位点在GC之间，产生的片段为平末端。 5'--GG CC--3' 3'--CC GG--5
•HaeⅢ酶的识别序列： 5' GG CC 3' 3' CC GG 5' •酶切位点在GC之间，产生的片段为平末端。 5 ' GG CC 3' 3 ' CC GG 5
pstI酶的识别的序列： 5'-CTGCAG一-3 3--GACGTC--5 酶切位点在AG之间，不在对称轴上，产生 的片段则为粘性末端。 5CTGCA G一一3 3一一G ACGTC5
•pst I酶的识别的序列： 5 ' CTGCAG 3' 3' GACGTC 5' •酶切位点在AG之间，不在对称轴上，产生 的片段则为粘性末端。 5 ' CTGCA G 3' 3' G ACGTC 5
SmaI --CCCGGG-- --GGGCCC-- 5'----CCC GGG----3 32----GGG CCC----5' 平端
5’----CCC GGG----3’ 3’----GGG CCC----5’ 平端 Sma I CCCGGG GGGCCC
EcoR I GAATTC- --·CTTAAG一- 5’--G AATTC--3’ 3'----CTTAA G--5 粘性末端
EcoR I GAATTC CTTAAG 5’----G AATTC----3’ 3’----CTTAA G----5’ 粘性末端
二、重组DNA克隆的载体及选择 特点： 1分子量小. 2.具备克隆位点 3.独立复制或整合复制 4.具有筛选标记 种类： 质粒载体 噬菌体载体 粘粒载体 YAC载体
二、重组DNA克隆的载体及选择 特点: 1分子量小. 2. 具备克隆位点 3.独立复制或整合复制 4. 具有筛选标记 种类: 质粒载体 噬菌体载体 粘粒载体 YAC载体
EcoR I,Sac I,Kpn I,Sma I,BamH I,Xba I,Sal L,Pst I,Sph I,Hind III Lac Z pUC 18/pUC19 2.69kb Ori Amp
pUC 18 / pUC19 (2.69kb) 质粒载体 EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I, Hind III Lac Z Ampr Ori
o互补原理： 质粒的LacZ仅编码β-半乳糖苷酶的氨基端 均无活性 宿主菌的LacZ仅编码β-半乳糖苷酶的羧基端 各自编码的肽链可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白。 5-嗅-4-氯-3-吲哚-B-半乳糖苷(X-ga)） B-半乳糖苷酶 异丙基硫代-B-D-半乳糖苷 (IPTG) 蓝色产物 蓝-白斑实验
互补原理: 质粒的Lac Z仅编码-半乳糖苷酶的氨基端 宿主菌的Lac Z仅编码-半乳糖苷酶的羧基端 均无活性 各自编码的肽链可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白。 5-嗅-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷（X-gal) 蓝色产物 -半乳糖苷酶 异丙基硫代--D-半乳糖苷 （IPTG) 蓝-白斑实验