·基因操作（重组DNA技术） ·重组DNA(分子克隆) ·分子杂交
• 基因操作（重组DNA技术） • 重组DNA（分子克隆） • 分子杂交
H2载体设计 噬菌体 ·入噬菌体 溶源性ysogenic phase 烈性ytic phase ·48.5kb/37-52kb/20kb 左臂 ↓个 右臂 ·cos sites(cohesive sites、.l2bp) 非必须序列 ·入载体(replacement vectors) EMBL3、入DASH 5 -CGGGGCGGCGACCTCG-3 3-GCCCCGCCGCTGGAGC-5' GGGCGGCGACCTCG-3' 5'-cG + GC-5' 3-GCCCCGCCGCTGGA
H2 载体设计——噬菌体 5’-CG + 3’-GCCCCGCCGCTGGA GGGCGGCGACCTCG-3’ + GC-5’ 5’-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’ 左臂 右臂 非必须序列 • 噬菌体 溶源性 lysogenic phase 烈性 lytic phase • 48.5kb / 37-52kb / 20kb • cos sites （cohesive sites、12bp） • 载体（replacement vectors） EMBL3、 DASH
3载体设计 粘粒 p BamHⅡ cos amp' cos Cosmid vector ori Cosmid vector 37~52kb ~5kb BamHI insert ori BamHI cos cos
H3 载体设计——粘粒 ori ampr Cosmid vector ~5kb cos BamHI ori ampr Cosmid vector 37~52kb cos BamHI BamHI insert cos cos insert
H3载体设计 YACs SnaB I CEN4 TEL-telomeric DNA SUP4 CEN4-centromere sequence ARS PYAC3 ARS酵母复制起点 TRP1 11.4kb URA3 TRP1-与p mutant互补 URA3-选择基因 SUP4-red-white color test TEL TEL
H3 载体设计——YACs SnaB I TEL TRP1 pYAC3 11.4kb SUP4 URA3 TEL ARS CEN4 insert TEL- telomeric DNA CEN4- centromere sequence ARS- 酵母复制起点 TRP1- 与 trp mutant 互补 URA3- 选择基因 SUP4- red-white color test
第二节目的基因的获得和检测 0 基因文库(gene library)又称DNA文库，是用 重组DNA技术和DNA克隆方法人工建立的包含 一个生物体或人的所有DNA序列克隆的集团为 基因组文库 。 cDNA文库mRNA逆转录成cDNA,然后 克隆到质粒或噬菌体重而形成的含有全 部cDNA的集团
第二节 目的基因的获得和检测 • 基因文库(gene library)又称DNA文库，是用 重组DNA技术和DNA克隆方法人工建立的包含 一个生物体或人的所有DNA序列克隆的集团为 基因组文库. • cDNA文库 mRNA 逆转录成cDNA，然后 克隆到质粒或噬菌体重而形成的含有全 部cDNA的集团
血细胞 DNA uman DNA Sau酶切消化 与载体重组 PLASMIDS 转化 mbinant 1 8g E PLAS 选择性增殖 NTO BACTE阳A @d900 genomic library
血细胞 DNA Sau酶切消化 与载体重组 转化 选择性增殖
转化或感染宿主菌 培养分离，形成菌 斑或噬斑。 (文库所形成的噬斑实际上要密得多)
转化或感染宿主菌 培养分离，形成菌 斑或噬斑。 （文库所形成的噬斑实际上要密得多）
CDNA文库的建立过程 RNA提取→分离mRNA 逆转录酶合成cDNA 连接噬菌体载体，一限制酶酶切处理一修饰cDNA链末端 包装噬菌体+感染、裂解宿主细胞 分装、保存 mRNA AAAAAAA TTTTTTT
cDNA文库的建立过程 AAAAAAA TTTTTTT RNA提取 分离mRNA 逆转录酶合成cDNA 连接噬菌体载体 限制酶酶切处理 修饰cDNA链末端 包装噬菌体 感染、裂解宿主细胞 分装、保存 mRNA
目的基因的检测 分子杂交：应用特异探针在复杂的靶DNA 中，根据碱基的互补性来鉴定与其同源的 DNA分子片断。 Radioactive sgolabsortb0npapo Membrane probe NCUE Selected colonies pape DEAN X-ray film
目的基因的检测 分子杂交：应用特异探针在复杂的靶DNA 中，根据碱基的互补性来鉴定与其同源的 DNA分子片断
·分子杂交技术方法 ·点印迹 斑点杂交(dot and slot hybridization) ● 等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO) SouthernE印迹法(Southern blot) ·Northern印迹法(Northern blot) ·Western印迹法(Western blot)
• 分子杂交技术方法 • 点印迹 • 斑点杂交(dot and slot hybridization) • 等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO ) • Southern印迹法(Southern blot) • Northern印迹法(Northern blot) • Western印迹法(Western blot)