《食品分析》教案 (第13次课2学时) 一、授课题目 第八章蛋白质和氨基酸的测定 第一节概述 第二节蛋白质的定量测定1 二、教学目的和要求 学习本章内容，要求学生了解蛋白质、蛋白质系数的概念，凯氏定氮 法原理和方法；掌握凯氏定氮装置的组件和安装、使用知识。熟练地掌握常量、 微量凯氏定氮法的操作技能。 三、教学重点和难点 重点： 凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 难点： 微量凯氏定氮仪的使用 四、主要参考资料 1、穆华荣、于淑萍主编，食品分析.北京：化学工业出版社，2004 2、周光理主编，食品分析与检验技术，北京：化学工业出版社，2006 3、杨月欣主编，实用食物营养成分分心手册（第二版），北京：中国轻工业出版社，2007 4、曲祖乙、刘靖主编，食品分析与检验.北京：中国环境科学出版社，2006 5.http://www.biox.cn/content/20050611/16631.htm 6http://www.shunz.net/tag/%E7%BA%BF%E6%80%A7%E7%9B%B8%E5%85%B3%E7%B3 %BB%E6%95%B0/ 7http://www.shunz.net/tag/%E7%BA%BF%E6%80%A7%E7%9B%B8%E5%85%B3%E7%B3
《食品分析》教案 （第 13 次课 2 学时） 一、授课题目 第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述 第二节 蛋白质的定量测定 1 二、教学目的和要求 学习本章内容，要求学生了解蛋白质、蛋白质系数的概念，凯氏定氮 法原理和方法；掌握凯氏定氮装置的组件和安装、使用知识。熟练地掌握常量、 微量凯氏定氮法的操作技能。 三、教学重点和难点 重点： 凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 难点： 微量凯氏定氮仪的使用 四、主要参考资料 1、穆华荣、于淑萍主编，食品分析.北京：化学工业出版社，2004 2、周光理主编，食品分析与检验技术，北京：化学工业出版社，2006 3、杨月欣主编，实用食物营养成分分心手册（第二版），北京：中国轻工业出版社，2007 4、曲祖乙、刘靖主编，食品分析与检验.北京：中国环境科学出版社，2006 5、http://www.biox.cn/content/20050611/16631.htm 6http://www.shunz.net/tag/%E7%BA%BF%E6%80%A7%E7%9B%B8%E5%85%B3%E7%B3 %BB%E6%95%B0/ 7http://www.shunz.net/tag/%E7%BA%BF%E6%80%A7%E7%9B%B8%E5%85%B3%E7%B3
%BB%E6%95%B0/ 五、教学过程 1、学时分配：2学时 2、辅导手段：自习答疑 3、教学办法：讲授 4、板书设计：（见上页） 5、教学内容： 第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节概述 一、蛋白质的生理功用及在食品中的作用 1、蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补 组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体的酸碱平衡、水平衡的维 持：遗传信息的传递：物质的代谢及运转都与蛋白质有关。 2、蛋白质是人体重要的营养物质。人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构 成自身的蛋白质，人体11%13%总热量来自蛋白质。 3、蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高 产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。 二、蛋白质系数 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万-数百万，分子的长 轴则长数nm-100m,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定 的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、 Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。 在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于 植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为 20%,牛乳为3.5%黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%， 菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同， 一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮相当于6.25份蛋白质，此数值(6.25)称为蛋白质
%BB%E6%95%B0/ 五、教学过程 1、学时分配：2 学时 2、辅导手段：自习答疑 3、教学办法：讲授 4、板书设计: (见上页) 5、教学内容： 第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述 一、蛋白质的生理功用及在食品中的作用 1、蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补 组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体的酸碱平衡、水平衡的维 持；遗传信息的传递；物质的代谢及运转都与蛋白质有关。 2、蛋白质是人体重要的营养物质。人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构 成自身的蛋白质，人体 11%~13%总热量来自蛋白质。 3、蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高 产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。 二、蛋白质系数 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万-数百万，分子的长 轴则长数 nm-100nm,它们由 20 种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定 的空间结构，所含的主要化学元素为 C、H、O、N，在某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、 Fe、I 等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。 在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于 植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉中为 9.5%，兔肉为 21%，鸡肉为 20%，牛乳为 3.5%黄鱼为 17.0%，带鱼为 18.0%，大豆为 40%，稻米 为 8.5%，面粉为 9.9%， 菠菜为 2.4%，黄瓜为 1.0%，桃为 0.8%，柑橘为 0.9%，苹果为 0.4%和油菜为 1.5%左右。 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同， 一般蛋白质含氮量为 16%，即一 份氮相当于 6.25 份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质
系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花 生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。 三、氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，目前分离得到的氨基酸己达175种以上，但是构 成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种。 在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、 色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基 酸，他们对人体有极其重要的生理作用。 以研究食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的组成为基础，从而提高蛋白质 的生理效价的食品开发研究成为一个热门话题。 四、蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测 定蛋白质含量：另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测 定蛋白质含量。 具体测定方法： 凯氏定氮法一一最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外： 红外分析仪 氨基酸总量一一酸碱滴定法测定。 各种氨基酸的分离与定量一一色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。 第二节蛋白质的定量测定 一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉9.5%，兔肉21%，肉20%，乳3.5%，鱼18.0%，豆40%，面粉9.9%， 菠菜2.4%，瓜1.0%，苹果1.4% 测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提 高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。 ·一些蛋白质的含氮量一般为15%17.6%，有的上下浮动 N N×6.25=蛋白质含量 16% 一、凯氏定氮法 过程：是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量， 由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等：含氮类 脂、卟啉和含氮的色素)，故此法的结果称为粗蛋白质含量
系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为 6.25，花 生为 5.46，大米为 5.95，大豆及其制品为 5.71，小麦粉为 5.70，牛乳及其制品为 6.38。 三、氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，目前分离得到的氨基酸已达 175 种以上，但是构 成蛋白质的氨基酸主要是其中的 20 种。 在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、 色氨酸和缬氨酸等 8 种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基 酸，他们对人体有极其重要的生理作用。 以研究食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的组成为基础，从而提高蛋白质 的生理效价的食品开发研究成为一个热门话题。 四、蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测 定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测 定蛋白质含量。 具体测定方法： 凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外： 红外分析仪 氨基酸总量——酸碱滴定法测定。 各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。 第二节 蛋白质的定量测定 一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉 9.5%，兔肉 21%，肉 20%，乳 3.5%，鱼 18.0%，豆 40%，面粉 9.9%， 菠菜 2.4%，瓜 1.0%，苹果 1.4% 测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提 高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。 •一些蛋白质的含氮量一般为 15%~ 17.6%，有的上下浮动 = N×6.25 = 蛋白质含量 一、凯氏定氮法 过程：是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量， 由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类 脂、卟啉和含氮的色素），故此法的结果称为粗蛋白质含量。 16% N
适用范围：凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用 于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用 较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。 方法：由Kieldh1于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法 及改良凯氏法。 微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。 目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。 在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作 的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。 主要学习 常量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法的原理、测定方法及操作技能，要求同学们能组装 仪器，能独立进行实验。 (一)常量凯氏定氮法 1、原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳 和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与疏酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 ①用HBO吸收后再以标准HC1溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 ②也可以用过量的标准H2SO,或标准HCI溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 (1)消化 总反应式： 2NH2(CH)2C00H+13H2S04=NH4)2S04+6C02+12S02+16H20 ①98%浓疏硫酸 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫。 H2S04+C=2S02+2H0+C02 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留 在酸性溶液中。 H,SO+2NH3 (NH)2SO4 ②加硫酸钾增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后可以提高至 400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾（沸点：1689℃）。 ③加硫酸铜催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化 汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。 ④加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。 (2)蒸馏 消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气
适用范围：凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用 于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用 较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。 方法：由 Kieldhl 于 1833 年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法 及改良凯氏法。 微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。 目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。 在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作 的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。 主要学习 常量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法的原理、测定方法及操作技能，要求同学们能组装 仪器，能独立进行实验。 （一）常量凯氏定氮法 1、原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳 和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 ① 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 ② 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 （1）消化 总反应式： 2NH2 (CH)2 COOH ＋ 13H2 SO4 ＝ (NH4 )2 SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O ①98%浓硫酸 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫。 H2 SO4 ＋C ＝2SO2 ＋ 2H2 O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留 在酸性溶液中。 H2 SO4 ＋2NH3 ＝ (NH4 ) 2 SO4 ②加硫酸钾 增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高至 400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾（沸点：1689℃）。 ③加硫酸铜 催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化 汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。 ④加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。 （2）蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气
2N2OH+(NH42S04=2NH3+Na2S04+2H20 (3)吸收与滴定 ①用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红一溴甲基酚绿 混合指示剂)国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂红色 绿色 红色 (酸) 吸收 (碱) 滴定 (酸) ②用过量的H2SO,或HC1标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液，用甲 基红指示剂。 2、适用范围 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定 3、操作方法：158页 (1)样品消化 准确称取均匀的固体样品0.5~3g,或半固体样品2~5g,或吸取溶液样品15~25ml。 小心移入干燥的凯氏烧瓶中（勿粘附在瓶壁上）。加入0.5~1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml 浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热 消化（若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利 用水力抽除消化过程所产生的烟气)。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失 后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h,冷却至室温。 (2)蒸馏、吸收 蒸留装置 消化装 常量凯氏定消化、德留装置 1一水力h气管2一水龙头3到置的干燥管4一儿氏烧瓶 万、7一电炉 8一蒸留烧瓶 6、9一铁支架10一进样和斗 11一冷凝管 12一接收驱 按图装好蒸馏装置 冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml40g/L硼酸溶液及混合指示剂 2-3滴)。 在凯氏烧瓶内加入100ml蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70ml400g/L
2N a OH＋ (NH4 ) 2 SO4＝ 2NH3↓＋ Na2 SO4 ＋ 2H2 O （3）吸收与滴定 ①用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿 混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸） ②用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲 基红指示剂。 2、适用范围 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定 3、 操作方法：158页 （1） 样品消化 准确称取均匀的固体样品 0.5～3g,或半固体样品 2～5g,或吸取溶液样品 15～25ml。 小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入 0.5～1g 硫酸铜、10g 硫酸钾及 25ml 浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈 45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热 消化（若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利 用水力抽除消化过程所产生的烟气）。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失 后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热 0.5h，冷却至室温。 （2）蒸馏、吸收 按图装好蒸馏装置 冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有 50ml 40g∕L 硼酸溶液及混合指示剂 2-3 滴）。 在凯氏烧瓶内加入 100ml 蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入 70ml 400g/L 吸收 滴定
氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏30mi,将蒸 馏装置出口离开液面继续蒸馏1min,用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。 “以奈氏试剂”检查氨是否全部蒸完， 奈氏试剂一一(Nessleri试剂，K2(HgI4))检验NH离子，遇铵根，离子析出黄色 或红棕色沉淀。 配制 方法1、3.5gKI+1.3gHgC12溶于70毫升水。加30毫升4mo1/L氢氧化钠（或 氢氧化钾)溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。 方法2、溶解11.5gHgI2+KI10g于适量少许水，后加水稀释至50ml,静置后， 取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。 (3)滴定 将接受瓶内的硼酸液用0.1mo1/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除 不加样品，从消化开始操作完全相同)。 4、结果计算：158页 注意：F一一氮换算为蛋白质的系数，一般为6.25也可查表。 5、说明： ①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无 硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 ③消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗 下，并促进其消化完全。 ④样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开 始消化时应用小火加热，并时时摇动：或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同 时注意控制热源强度。 ⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2一3m1后 再继续加热消化。 ⑥若取样量较大，如干试样超过5g可按每克试样5m1的比例增加硫酸用量。 ⑦一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物 的样品.如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有 机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑧蒸馏装置不能漏气。 ⑨蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠 用量。氧化铜在70~90℃时发黑。 ⑩硼酸吸收液的温度不应超过40°C,否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。 ①蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源.否则 可能造成吸收液倒吸。 ©混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色
氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏 30min，将蒸 馏装置出口离开液面继续蒸馏 1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。 “以奈氏试剂”检查氨是否全部蒸完， 奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕 检验NH4 +离子，遇铵根，离子析出黄色 或红棕色沉淀。 配制 方法1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或 氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。 方法2、 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后， 取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。 （3）滴定 将接受瓶内的硼酸液用 0.1mol/L 盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除 不加样品，从消化开始操作完全相同）。 4、 结果计算：158页 注意：F——氮换算为蛋白质的系数，一般为6.25 也可查表。 5、 说明： ①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无 硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 ③消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗 下，并促进其消化完全。 ④样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开 始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同 时注意控制热源强度。 ⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后 再继续加热消化。 ⑥若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。 ⑦—般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物 的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有 机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑧蒸馏装置不能漏气。 ⑨蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠 用量。氧化铜在70～90℃时发黑。 ⑩硼酸吸收液的温度不应超过 40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。 ○11 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则 可能造成吸收液倒吸。 ○12 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色
(二)、微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50ml10ml, 滴定用盐酸浓度由0.1mo1/L 0.01mol/L, 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置见159页图10-2。 4、操作方法（结合实验书来讲） (1)消化：要将消化完全后的消化液定容到100mL容量瓶。 (2)装置的安装：与常量法不同，将在技能教学中讲述。 (3)蒸馏、吸收：与常量法不同的是 取样品定容液10mL,1/10 吸收液硼酸10mL 用水蒸汽蒸出氨 注意问题：在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出：加碱量要足， 操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出：要注意控制热源使蒸汽产生稳定，不能太猛或太 弱：要注意各蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。 (4)滴定：滴定用0.0100mol/LHC1标准溶液。 (三)、自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点： (1)消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 (2)快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 (3)自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量 并记录，12分钟完成1个样。 六、作业 1、画出微量凯氏定氮法的正确的蒸馏装置图，并标明各部分的名称。 2、简述凯氏定氮法的基本原理。 3、凯氏定氮法操作中应注意哪些问题？ 4、现抽取双汇集团生产软塑包装的双汇牌火腿肠10公斤（样品批号为2004062518），要 求测定粗蛋白含量。 (1)某分析检验员称取经搅碎混匀的火腿0.50g于100mL凯氏烧瓶中。请写出此后的 样品处理步骤。 (2)将消化液冷却后，转入100ml容量瓶中定容.移取消化稀释液10mL于微量凯氏定 氮蒸馏装置的反应管中，用水蒸汽蒸馏，2%硼酸吸收后，馏出液用0.0998mo1/L盐酸滴定至 终点，消耗盐酸5.12mL.计算该火腿肠中粗蛋白含量
（二）、微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置见 159 页图 10-2 。 4、操作方法（结合实验书来讲） （1）消化：要将消化完全后的消化液定容到 100mL 容量瓶。 （2）装置的安装：与常量法不同，将在技能教学中讲述。 （3）蒸馏、吸收：与常量法不同的是 取样品定容液 10mL，1/10 吸收液硼酸 10mL 用水蒸汽蒸出氨 注意问题：在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出；加碱量要足， 操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出；要注意控制热源使蒸汽产生稳定，不能太猛或太 弱；要注意各蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。 （4）滴定：滴定用 0.0100mol/L HCl 标准溶液。 （三）、自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量 并记录，12分钟完成1个样。 六、作业 1、画出微量凯氏定氮法的正确的蒸馏装置图，并标明各部分的名称。 2、简述凯氏定氮法的基本原理。 3、凯氏定氮法操作中应注意哪些问题？ 4、现抽取双汇集团生产软塑包装的双汇牌火腿肠10公斤（样品批号为2004062518），要 求测定粗蛋白含量。 （1）某分析检验员称取经搅碎混匀的火腿0.50g于100mL凯氏烧瓶中。请写出此后的 样品处理步骤。 （2）将消化液冷却后,转入100mL容量瓶中定容. 移取消化稀释液10mL于微量凯氏定 氮蒸馏装置的反应管中,用水蒸汽蒸馏,2%硼酸吸收后,馏出液用0.0998mol/L盐酸滴定至 终点,消耗盐酸5.12mL.计算该火腿肠中粗蛋白含量
食品分析》教案 (第14次课2学时) 一、授课题目 第八章蛋白质和氨基酸的测定 第二节蛋白质的定量测定2 第三节氨基酸的定量测定 第四节氨基酸的分离与测定 二、教学目的和要求 学习本章内容，要求学生了解氨基酸的概念及测定原理：掌握LC法原 理和方法。 三、教学重点和难点 重点： 双缩脲法测定原理。 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 TLC法原理、方法，Rf值的作用及计算方法。 难点： 茚三酮比色法的测定法 四、主要参考资料 1、穆华荣、于淑萍主编，食品分析.北京：化学工业出版社，2004 2、周光理主编，食品分析与检验技术，北京：化学工业出版社，2006 3、杨月欣主编，实用食物营养成分分心手册（第二版），北京：中国轻工业出版社，2007 4、曲祖乙、刘靖主编，食品分析与检验.北京：中国环境科学出版社，2006 5.http://www.biox.cn/content/20050611/16631.htm 6http://www.shunz.net/tag/%E7%BA%BF%E6%80%A7%E7%9B%B8%E5%85%B3%E7%B3
食品分析》教案 （第 14 次课 2 学时） 一、授课题目 第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第二节 蛋白质的定量测定 2 第三节 氨基酸的定量测定 第四节 氨基酸的分离与测定 二、教学目的和要求 学习本章内容，要求学生了解氨基酸的概念及测定原理；掌握 TLC 法原 理和方法。 三、教学重点和难点 重点： 双缩脲法测定原理。 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 TLC 法原理、方法，Rf 值的作用及计算方法。 难点： 茚三酮比色法的测定法 四、主要参考资料 1、穆华荣、于淑萍主编，食品分析.北京：化学工业出版社，2004 2、周光理主编，食品分析与检验技术，北京：化学工业出版社，2006 3、杨月欣主编，实用食物营养成分分心手册（第二版），北京：中国轻工业出版社，2007 4、曲祖乙、刘靖主编，食品分析与检验.北京：中国环境科学出版社，2006 5、http://www.biox.cn/content/20050611/16631.htm 6http://www.shunz.net/tag/%E7%BA%BF%E6%80%A7%E7%9B%B8%E5%85%B3%E7%B3
%BB%E6%95%B0☑ 7http://www.shunz.net/tag/%E7%BA%BF%E6%80%A7%E7%9B%B8%E5%85%B3%E7%B3 %BB%E6%95%B0☑ 五、教学过程 1、学时分配：2学时 2、辅导手段：自习答疑 3、教学办法：讲授 4、板书设计：（见上页) 5、教学内容 第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第二节蛋白质的定量测定 二、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污 染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。 1、原理 脲（尿素）NH2一C0一NH2加热至150160℃时，两分子缩和成双缩脲。 NH2-CO-NH2+NH2-CO-NH2 H2-CO-NH-CO-NH2+NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反 应) 蛋白质分子中含有肽键一C0一NH一与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反 应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确 定含量。(560nm)
%BB%E6%95%B0/ 7http://www.shunz.net/tag/%E7%BA%BF%E6%80%A7%E7%9B%B8%E5%85%B3%E7%B3 %BB%E6%95%B0/ 五、教学过程 1、学时分配：2 学时 2、辅导手段：自习答疑 3、教学办法：讲授 4、板书设计: (见上页) 5、教学内容 第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第二节 蛋白质的定量测定 二、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污 染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。 1、原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。 NH2—CO—NH2 +NH2—CO—NH2 H2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反 应） 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反 应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确 定含量。（560nm）
注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化 2、方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。 本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 3、主要仪器：分光光度计，离心机(4000r/min) 4、试剂： (1)碱性硫酸铜溶液 (2)四氯化碳 5、操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。 三。紫外吸收法 1、原理：利用蛋白质的特有基团， (NH-CH-CO 对紫外光有吸收作用在280nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。 2、适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3、主要仪器： ①紫外分光光度计 ②离心机(3000一5000r/min) 4、操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线 四、福林-酚比色法 蛋白质与福林-酚试剂反应，产生蓝色复合物。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检 测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。 五、考马斯亮蓝染料比色法 考马斯亮蓝G-250,蛋白质染料，与蛋白质通过范德华力引力结合，使蛋白质染色， 在620nm处有最大吸收值。 六、染料结合法 蛋白质+染料 沉淀物 剩余染料 →分光光度计测定 七、水杨酸比色法 硫酸 样品 铵盐 温度酸度， 蓝色络合物(660nm) 消化 次氯酸钠
注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化 2、方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。 本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 3、主要仪器： 分光光度计，离心机（4000 r/min） 4、试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳 5、操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。 三．紫外吸收法 1、原理：利用蛋白质的特有基团， 对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。 2、适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3、主要仪器： ① 紫外分光光度计 ② 离心机（3000 — 5000 r/min） 4、操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线 四、福林-酚比色法 蛋白质与福林-酚试剂反应，产生蓝色复合物。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检 测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。 五、考马斯亮蓝染料比色法 考马斯亮蓝 G-250，蛋白质染料，与蛋白质通过范德华力引力结合，使蛋白质染色， 在 620nm 处有最大吸收值。 六、染料结合法 沉淀物 剩余染料 分光光度计测定 七、水杨酸比色法 铵盐 蓝色络合物（660nm） （— NH—CH—CO） │ R 蛋白质+染料 样品 硫 酸 消 化 温度酸度 次氯酸钠
