项目12乌鸡白凤丸的微生物限度检查 重庆医药高等专科学校
重庆医药高等专科学校 项目12 乌鸡白凤丸的微生物限度检查
一、药品微生物限度检查 1、几个名词解释 (1)微生物的概念 所谓微生物是一群个体微小、结构简单肉眼不能直接看到，必须借 助显微镜以及其它手段才能辨别的微小生物。 (2)菌落 一般是指在固体培养基上，由细菌单细胞经过适宜温度培养在一个 局部位置上，繁殖而成的可见菌体细胞群。 (3)无菌技术 无菌技术主要指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污 染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施，无 菌实验器材以及无菌操作等统称为无菌技术
一、药品微生物限度检查 1、几个名词解释 （1）微生物的概念 所谓微生物是一群个体微小、结构简单肉眼不能直接看到，必须借 助显微镜以及其它手段才能辨别的微小生物。 （2）菌落 一般是指在固体培养基上，由细菌单细胞经过适宜温度培养在一个 局部位置上，繁殖而成的可见菌体细胞群。 （3）无菌技术 无菌技术主要指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污 染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施，无 菌实验器材以及无菌操作等统称为无菌技术
(4)消毒 消毒是指杀灭病因微生物的繁殖体，但杀不死芽孢等全部微生 物。 常用的清毒剂的种类 75%乙醇、甲醛、碘酊、0.1%新洁尔灭、乳酸、过氧乙酸、3% 来苏尔、过氧化氢等。 (5)灭菌 凡能杀灭物体中所有微生物繁殖体及芽孢或孢子的作用称为灭 菌。 常用的灭菌方法 (5.1)干热灭菌法 (5.2)湿热灭菌法
（4）消毒 消毒是指杀灭病因微生物的繁殖体，但杀不死芽孢等全部微生 物。 常用的清毒剂的种类 75%乙醇、甲醛、碘酊、0.1%新洁尔灭、乳酸、过氧乙酸、3% 来苏尔、过氧化氢等。 （5）灭菌 凡能杀灭物体中所有微生物繁殖体及芽孢或孢子的作用称为灭 菌。 常用的灭菌方法 (5．1)干热灭菌法 (5．2)湿热灭菌法
(6)微生物限度检查法定义 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微 生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵菌数及控制 菌检查。 (6.1)操作环境 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的 单向流空气区域内进行。检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止再 污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室 (区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行 洁净验证。 (6.2)培养温度和时间 本检查法中细菌培养温度为3035°C;时间为48小时。霉菌、酵 母菌培养温度为2328°C;时间为72小时。控制菌培养温度为3537 °C:时间为48小时。 眼用制剂微生物限度检查用薄膜过滤法，培养时间为7天
（6）微生物限度检查法定义 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微 生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵菌数及控制 菌检查。 （6．1）操作环境 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的 单向流空气区域内进行。检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止再 污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室 （区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行 洁净验证。 （6．2） 培养温度和时间 本检查法中细菌培养温度为30~35ºC；时间为48小时。霉菌、酵 母菌培养温度为23~28 ºC；时间为72小时。控制菌培养温度为35~37 ºC；时间为48小时。 眼用制剂微生物限度检查用薄膜过滤法，培养时间为7天
2、微生物限度检查方法学验证 (1)验证采用的方法： ①常规法 ②稀释法 ③离心沉淀集菌法 ④薄膜过滤法 ⑤中和法 ⑥离心和培养基稀释法 ⑦离心和薄膜过滤法
2、微生物限度检查方法学验证 （1）验证采用的方法： ①常规法 ②稀释法 ③离心沉淀集菌法 ④薄膜过滤法 ⑤中和法 ⑥离心和培养基稀释法 ⑦离心和薄膜过滤法
(2)细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 (2.1)菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌 种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜 的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 (1)大肠埃希菌(CMCC(B)44102) (2)金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003) (3)枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501) (4)白色念珠菌(CMCC(F)98001) (5)黑曲霉(CMCC(F)98003)
（2）细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 （2．1）菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌 种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜 的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 （1）大肠埃希菌(CMCC (B) 44102) （2）金黄色葡萄球菌(CMCC(B) 26003) （3）枯草芽孢杆菌(CMCC(B) 63501) （4）白色念珠菌(CMCC(F) 98001) （5）黑曲霉(CMCC(F) 98003)
(2.2)菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆 菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂养基中，培 养1824)小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁 培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养2428小时。上述 培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m1含菌数为 50100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜养物至改良马丁 琼脂斜面培养基中，培养57天，加入35m10.9%无菌氯化 钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口塞有 适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的 无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制 成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液
(2．2)菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆 菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂养基中，培 养18~24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁 培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24~28小时。上述 培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m1含菌数为 50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜养物至改良马丁 琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5m10.9%无菌氯化 钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口塞有 适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的 无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制 成每1m1含孢子数50~100cfu的孢子悬液
(2.3)验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的 回收率。 首先应进行预试验，做金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率，然后再确定验 证方法。 (1)试验组平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1m1和 50~100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀 释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按 薄膜过滤法测定其菌数。 (2)菌液组测定所加的试验菌数 (3)供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数法测定供试品本底菌数。 (4)稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特 殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 试验时，可用相应的稀释液代替供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1l供试液 含50100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数
（2．3）验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的 回收率。 首先应进行预试验，做金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率，然后再确定验 证方法。 （1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1m1和 50~100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀 释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50~100cfu试验菌，过滤，按 薄膜过滤法测定其菌数。 （2）菌液组 测定所加的试验菌数 （3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数法测定供试品本底菌数。 （4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特 殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 试验时，可用相应的稀释液代替供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1m1供试液 含50~100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数
(2.4)结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平 均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。若试验组的菌回 收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的 平均菌数的百分率)均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品 的细菌、霉菌及酵母菌数：若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采 用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用 这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 当最低稀释级的供试液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法 后试验菌的回收率还无法达到计数方法验证的要求时，根据供试品的微生物 限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，可采用高一稀 释级的供试液重新进行回收率的测定。若试验菌的回收率符合计数方法验证 的要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行试验。 验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行
（2．4）结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平 均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的菌回 收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的 平均菌数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品 的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采 用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用 这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 当最低稀释级的供试液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法 后试验菌的回收率还无法达到计数方法验证的要求时，根据供试品的微生物 限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，可采用高一稀 释级的供试液重新进行回收率的测定。若试验菌的回收率符合计数方法验证 的要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行试验。 验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行
(3)细菌、霉菌及酵母菌计数方法 试验准备：（干热灭菌、湿热灭菌） 把灭菌好的所有物品搬运至传递窗，打开 紫外灯杀菌，至少30分钟。 检查时，按已验证的计数方法进行供试品 的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。 取按验证的方法制备的均匀供试液，用 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：10 、1:102、1:103等稀释级
（3）细菌、霉菌及酵母菌计数方法 试验准备：（干热灭菌、湿热灭菌） 把灭菌好的所有物品搬运至传递窗，打开 紫外灯杀菌，至少30分钟。 检查时，按已验证的计数方法进行供试品 的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。 取按验证的方法制备的均匀供试液，用 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：10 、1：10²、1：10³等稀释级