《发酵工程及设备》 实验指导书 （适用专业：生物工程） 2005 年 4 月 目 录 实验一 土壤中产醋酸菌种的分离筛选.1 实验二 紫外线的诱变育种.2 实验三 摇床培养确定酵母菌体培养和营养条件.3 实验四 细菌增殖曲线的测定.4 实验五 木霉 T6 淀粉酶的固态发酵实验.6 实验六 小型连续发酵实验.9 实验七 啤酒麦芽汁制备实验.11 实验八 啤酒的酿造.14
《发酵工程及设备》 实验指导书 （适用专业：生物工程） 2005 年 4 月 目 录 实验一 土壤中产醋酸菌种的分离筛选.1 实验二 紫外线的诱变育种.2 实验三 摇床培养确定酵母菌体培养和营养条件.3 实验四 细菌增殖曲线的测定.4 实验五 木霉 T6 淀粉酶的固态发酵实验.6 实验六 小型连续发酵实验.9 实验七 啤酒麦芽汁制备实验.11 实验八 啤酒的酿造.14
实验九 啤酒风味保鲜期的测定.15 实验十 反应器的安装与拆卸.16 实验十一 pH 电极的校正.17 实验十二 氧电极的校正.19 实验十三 体积溶氧传递系数的测定.21 实验十四 反应器培养液的灭菌与接种培养.23 实验十五 气升式生化反应器的使用.24 实验十六 中试发酵设备的使用方法.25 实验十七 补料分批发酵动力学研究.27 实验一 土壤中产醋酸菌种的分离筛选 一．实验目的： 1．根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产，建立不同的筛选模型，并从特定的样 品如土壤中筛选出高产适宜的菌株。 2．加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科 学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 二．基本原理： 分离上样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集，但对某些少数细菌则要求特殊的 富集或选择技术才能很好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗 生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立若干富集技术。 同样，富集可以促进抗性的产生并维持下来。 三．培养基与仪器 1．培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基 2．仪器：全自动高压灭菌锅，培养箱，酸式滴定管 四．实验步骤 1. 确定方案：首先查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 2. 采样：选取离地面 5～15 cm 处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋 或玻璃瓶中。 3. 增殖：称取 0.5g 土样（湿重），加到含 10ml 25%无菌土样浸出汁的试管中，于 26℃、 150rpm 条件下振荡培养 25min，以适宜的样本稀释液系列稀释培养液。然后取 0.1 m1 涂布 于已添加及未添加富集底物的土浸出汁平板。26℃下皿底朝上培养 4—10 天，将长出的菌落
实验九 啤酒风味保鲜期的测定.15 实验十 反应器的安装与拆卸.16 实验十一 pH 电极的校正.17 实验十二 氧电极的校正.19 实验十三 体积溶氧传递系数的测定.21 实验十四 反应器培养液的灭菌与接种培养.23 实验十五 气升式生化反应器的使用.24 实验十六 中试发酵设备的使用方法.25 实验十七 补料分批发酵动力学研究.27 实验一 土壤中产醋酸菌种的分离筛选 一．实验目的： 1．根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产，建立不同的筛选模型，并从特定的样 品如土壤中筛选出高产适宜的菌株。 2．加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科 学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 二．基本原理： 分离上样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集，但对某些少数细菌则要求特殊的 富集或选择技术才能很好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗 生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立若干富集技术。 同样，富集可以促进抗性的产生并维持下来。 三．培养基与仪器 1．培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基 2．仪器：全自动高压灭菌锅，培养箱，酸式滴定管 四．实验步骤 1. 确定方案：首先查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 2. 采样：选取离地面 5～15 cm 处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋 或玻璃瓶中。 3. 增殖：称取 0.5g 土样（湿重），加到含 10ml 25%无菌土样浸出汁的试管中，于 26℃、 150rpm 条件下振荡培养 25min，以适宜的样本稀释液系列稀释培养液。然后取 0.1 m1 涂布 于已添加及未添加富集底物的土浸出汁平板。26℃下皿底朝上培养 4—10 天，将长出的菌落
接入斜面，但应挑分离成单个的，以免不纯。 4. 分离：利用产物特性分离得到产目标产物的纯种。 初筛：将细菌接种到含有一定的碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行培养，如果 细菌产酸则培养基出现混浊半透明状态，可以根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小初步筛选 出产酸高的菌种。 复筛：将初筛菌种在斜面培养纯化后，接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中 37℃深层培养 24 h 后。取出培养液 5m1 加入试管内，加 0.1moL/LNaOH 液中和，然后加氯化铁液 2—3 滴， 摇匀，观察液色是否变为黄红色，如将试管放在火焰上煮沸，有无红褐色沉淀生出，根据所 消耗的 NaOH 量确定产物醋酸的具体生成量。 五．实验结果 菌 株 1 2 3 4 5 6 NaOH 的消耗量（ml） 醋酸的生成量（ml） 反应液颜色变化 六．思考题 如果培养中有其它种挥发酸共存，应采用什么方法来测定醋酸的生成量？ 实验二 紫外线的诱变育种 一．目的要求 通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 二．基本原理 紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是 DNA 的分子结构发生改变（同链 DNA 的相 邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。 三．菌种与仪器 菌种：枯草芽孢杆菌； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四．操作步骤 （1）菌悬液的制备 （a）取培养 48 小时的枯草芽孢杆菌的斜面 4—5 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒 入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡 30 分钟，以打碎菌块。 （b）将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐 水洗涤 2—3 次，最后制成菌悬液。 （c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108 个。 （2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55℃左右时倒平板，凝固后待用。 （3）紫外线处理 （a）将紫外线灯开关打开预热约 20 分钟。 （b）取直径 6cm 无菌平皿 2 套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿 中。 （c）将盛有菌悬液的 2 平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W 的紫外 线灯下分别搅拌照射 1 分钟及 3 分钟。 (4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以 10 倍稀释法稀释成 10-1 -10-6（具体可 按估计的存活率进行稀释）
接入斜面，但应挑分离成单个的，以免不纯。 4. 分离：利用产物特性分离得到产目标产物的纯种。 初筛：将细菌接种到含有一定的碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行培养，如果 细菌产酸则培养基出现混浊半透明状态，可以根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小初步筛选 出产酸高的菌种。 复筛：将初筛菌种在斜面培养纯化后，接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中 37℃深层培养 24 h 后。取出培养液 5m1 加入试管内，加 0.1moL/LNaOH 液中和，然后加氯化铁液 2—3 滴， 摇匀，观察液色是否变为黄红色，如将试管放在火焰上煮沸，有无红褐色沉淀生出，根据所 消耗的 NaOH 量确定产物醋酸的具体生成量。 五．实验结果 菌 株 1 2 3 4 5 6 NaOH 的消耗量（ml） 醋酸的生成量（ml） 反应液颜色变化 六．思考题 如果培养中有其它种挥发酸共存，应采用什么方法来测定醋酸的生成量？ 实验二 紫外线的诱变育种 一．目的要求 通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 二．基本原理 紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是 DNA 的分子结构发生改变（同链 DNA 的相 邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。 三．菌种与仪器 菌种：枯草芽孢杆菌； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四．操作步骤 （1）菌悬液的制备 （a）取培养 48 小时的枯草芽孢杆菌的斜面 4—5 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒 入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡 30 分钟，以打碎菌块。 （b）将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐 水洗涤 2—3 次，最后制成菌悬液。 （c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108 个。 （2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55℃左右时倒平板，凝固后待用。 （3）紫外线处理 （a）将紫外线灯开关打开预热约 20 分钟。 （b）取直径 6cm 无菌平皿 2 套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿 中。 （c）将盛有菌悬液的 2 平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W 的紫外 线灯下分别搅拌照射 1 分钟及 3 分钟。 (4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以 10 倍稀释法稀释成 10-1 -10-6（具体可 按估计的存活率进行稀释）
(5)涂平板取 10-4、10-5、10-6 三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3 只，每只平板加 稀释菌液 0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平 板作对照。 (6)培养 将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置 37℃培养 48 小时。注意每个平皿背面 要标明处理时间和稀释度。 (7)计数将培养 48 小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每 毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 1 分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。 (8)观察诱变效应 将细胞计数后的平板，分别向菌落数在 5—6 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围 将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC 值）。与对照平板进行 比较，根据结果，说明诱变效应。并选取 HC 比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面 可作复筛用。 五．实验结果 1．结果 将实验结果填入下表。 稀释 倍数 平均菌落 处理时间 （数/皿） 诱变剂 （min） 10-4 10-5 10-6 存活率% 致死率% 紫外线 （UV） 0（对照） 1 3 结 果 处理 透明圈和菌落直径大小（㎜）及其 HC 比值 1 2 3 4 5 6 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 UV 处理 对照 六．思考题 (1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？ (2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？ 实验三 摇床培养确定酵母菌体培养和营养条件 一．实验目的：
(5)涂平板取 10-4、10-5、10-6 三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3 只，每只平板加 稀释菌液 0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平 板作对照。 (6)培养 将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置 37℃培养 48 小时。注意每个平皿背面 要标明处理时间和稀释度。 (7)计数将培养 48 小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每 毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 1 分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。 (8)观察诱变效应 将细胞计数后的平板，分别向菌落数在 5—6 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围 将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC 值）。与对照平板进行 比较，根据结果，说明诱变效应。并选取 HC 比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面 可作复筛用。 五．实验结果 1．结果 将实验结果填入下表。 稀释 倍数 平均菌落 处理时间 （数/皿） 诱变剂 （min） 10-4 10-5 10-6 存活率% 致死率% 紫外线 （UV） 0（对照） 1 3 结 果 处理 透明圈和菌落直径大小（㎜）及其 HC 比值 1 2 3 4 5 6 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 UV 处理 对照 六．思考题 (1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？ (2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？ 实验三 摇床培养确定酵母菌体培养和营养条件 一．实验目的：
掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实 验室发酵工艺。 二．实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以 均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。 三．仪器与试剂 1．仪器设备 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。 2．试剂 （1）葡萄糖标准溶液： 准确称取 100 ml 分析纯葡萄糖（预先在 105℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸 馏水溶解后，定量转移到 100 ml 的容量瓶中，以蒸馏水定容，冰箱中保存备用。 （2）3, 5－二硝基水杨酸试剂（DNS 试剂）： 甲液： 溶解 6.9 g 苯酚于 15.2 ml 10％氢氧化钠中，并稀释至 69 ml，在此溶液中加 入 6.9 g 亚硫酸氢钠。 乙液： 称取 22.5 g 酒石酸钾钠，加到 300 ml 10％氢氧化钠溶液中，再加入 880 ml1％ 的 3、5－二硝基水杨酸溶液。 将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，放置 7－10 天以后使用。 （3）37％甲醛溶液 （4）0.05 mol/L 氢氧化钠溶液：称取 2 g 氢氧化钠，溶于水并稀释至 1000 ml。 四．实验方法 （1）培养基的配制(见表 1,2) 表 1 正交表试验设计 因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 1.0 0.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表 2 正交表实验方案 编号 葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 生物量 （OD） 0h 12h 24h 36h 48h 60h 1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) （2）将上述培养基配制好以后，每 250 ml 三角瓶装入培养基 100 ml，于 121℃下灭菌 30 min，冷却。 （3）冷却后接种（接种量为 5％），置于 28℃培养箱进行培养
掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实 验室发酵工艺。 二．实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以 均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。 三．仪器与试剂 1．仪器设备 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。 2．试剂 （1）葡萄糖标准溶液： 准确称取 100 ml 分析纯葡萄糖（预先在 105℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸 馏水溶解后，定量转移到 100 ml 的容量瓶中，以蒸馏水定容，冰箱中保存备用。 （2）3, 5－二硝基水杨酸试剂（DNS 试剂）： 甲液： 溶解 6.9 g 苯酚于 15.2 ml 10％氢氧化钠中，并稀释至 69 ml，在此溶液中加 入 6.9 g 亚硫酸氢钠。 乙液： 称取 22.5 g 酒石酸钾钠，加到 300 ml 10％氢氧化钠溶液中，再加入 880 ml1％ 的 3、5－二硝基水杨酸溶液。 将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，放置 7－10 天以后使用。 （3）37％甲醛溶液 （4）0.05 mol/L 氢氧化钠溶液：称取 2 g 氢氧化钠，溶于水并稀释至 1000 ml。 四．实验方法 （1）培养基的配制(见表 1,2) 表 1 正交表试验设计 因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 1.0 0.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表 2 正交表实验方案 编号 葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 生物量 （OD） 0h 12h 24h 36h 48h 60h 1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) （2）将上述培养基配制好以后，每 250 ml 三角瓶装入培养基 100 ml，于 121℃下灭菌 30 min，冷却。 （3）冷却后接种（接种量为 5％），置于 28℃培养箱进行培养
（4）测 0D 值：将接种 0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 不同时间的菌悬液摇均匀 后于 560nm 波长、1cm 比色皿中测定 0D 值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照， 并将 0D 值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五．思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用 560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定 大肠杆菌生长的 0D 值，你将如何选择波长? 实验四 细菌增殖曲线的测定 一．实验目的： 通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线图 二．实验原理 大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每 20mln 分 裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、 对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为 纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲 线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线， 了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意 义。 三．菌种与培养基 菌种：大肠杆菌 种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 发酵培养基：葡萄糖 2g/L，Nacl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调 pH 至 7.2。 四．仪器 光电比色计，摇床，冰箱 五．操作步骤 1、将在种子培养基中培养 20 h 的培养液 3000rpm 离心 10min 倾去上层液，加入无菌的 生理盐水，成均匀液，细胞数系 109 /m1。 2．取 10 个盛发酵培养液的三角瓶，各接 3m1 菌液作种子，在摇床上相同位置 30℃振 荡培养，并立即取下一瓶为 0 时的增殖状态．之后于培养 1、2、3、4、5、6、7、8、9 各取 一瓶，约 9 个间隔的菌液分别吸取 5m1 菌于无菌试管中，置 4℃下保存。 3．用没接种的培养液为空白对照，将上述菌液于波长 600nm 处比色，但要求消光度在 0.3 一 0.6 之间，若超过，用未接种培养液适当稀释。 六．实验结果： 1．结果 (1) 将测定的 OD600 值填入下表 培养时间（h） 对照 0 1.5 3 4 5 6 7 8 9 10 12 光密度值 OD600 （2）以菌悬液 0D 值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌培养的增殖曲线．
（4）测 0D 值：将接种 0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 不同时间的菌悬液摇均匀 后于 560nm 波长、1cm 比色皿中测定 0D 值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照， 并将 0D 值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五．思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用 560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定 大肠杆菌生长的 0D 值，你将如何选择波长? 实验四 细菌增殖曲线的测定 一．实验目的： 通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线图 二．实验原理 大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每 20mln 分 裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、 对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为 纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲 线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线， 了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意 义。 三．菌种与培养基 菌种：大肠杆菌 种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 发酵培养基：葡萄糖 2g/L，Nacl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调 pH 至 7.2。 四．仪器 光电比色计，摇床，冰箱 五．操作步骤 1、将在种子培养基中培养 20 h 的培养液 3000rpm 离心 10min 倾去上层液，加入无菌的 生理盐水，成均匀液，细胞数系 109 /m1。 2．取 10 个盛发酵培养液的三角瓶，各接 3m1 菌液作种子，在摇床上相同位置 30℃振 荡培养，并立即取下一瓶为 0 时的增殖状态．之后于培养 1、2、3、4、5、6、7、8、9 各取 一瓶，约 9 个间隔的菌液分别吸取 5m1 菌于无菌试管中，置 4℃下保存。 3．用没接种的培养液为空白对照，将上述菌液于波长 600nm 处比色，但要求消光度在 0.3 一 0.6 之间，若超过，用未接种培养液适当稀释。 六．实验结果： 1．结果 (1) 将测定的 OD600 值填入下表 培养时间（h） 对照 0 1.5 3 4 5 6 7 8 9 10 12 光密度值 OD600 （2）以菌悬液 0D 值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌培养的增殖曲线．
七．思考题 (1) 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点? (2) 细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短?若细胞密度为 103／m1，培 养 4.5h 后，其密度高达 2×108／m 3，请计算出其代时。 (3) 次生代谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使 次生代谢产物积累更多？ 实验五 木霉 T6 淀粉酶的固态发酵实验 1．实验目的 了解和掌握木霉 T6 菌株在发酵过程中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质浓度的时间变化曲 线和测定方法。 2． 基本原理 淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解 a－1，4－葡萄 糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与 3、5－二硝基水杨酸共热，3、5－二硝基水 杨酸被还原为 3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在 722 型分 光光度计 540 nm 波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原 糖的含量，从而求出淀粉酶的活力。 3．培养基 培养基（250mL）：麸皮 7g ，面粉 0.5g，NaNO3 0.15g，营养盐 6.5mL，pH 自然。 营养盐配方（g/L）：KH2PO4 3.0；(NH4)2SO4 2.0；Cacl2 0.5；MgSO4.7H2O 0.5；Cocl2 0.003； FeSO4 .7H2O 0.0075；ZnSO4 0.002； pH5~6。 四．实验方法： 1．还原糖的测定 （1）标准曲线的制作 取 9 支干燥试管，编号，按下表所示的量，精确浓度为 1.00 mg/ml 的葡萄糖标准液和 3， 5－二硝基水杨酸试剂。表中单位为 ml。 表 1 还原糖标准曲线制作 管号 加入试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.4 0 培养时间（h） OD600 值 0
七．思考题 (1) 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点? (2) 细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短?若细胞密度为 103／m1，培 养 4.5h 后，其密度高达 2×108／m 3，请计算出其代时。 (3) 次生代谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使 次生代谢产物积累更多？ 实验五 木霉 T6 淀粉酶的固态发酵实验 1．实验目的 了解和掌握木霉 T6 菌株在发酵过程中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质浓度的时间变化曲 线和测定方法。 2． 基本原理 淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解 a－1，4－葡萄 糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与 3、5－二硝基水杨酸共热，3、5－二硝基水 杨酸被还原为 3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在 722 型分 光光度计 540 nm 波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原 糖的含量，从而求出淀粉酶的活力。 3．培养基 培养基（250mL）：麸皮 7g ，面粉 0.5g，NaNO3 0.15g，营养盐 6.5mL，pH 自然。 营养盐配方（g/L）：KH2PO4 3.0；(NH4)2SO4 2.0；Cacl2 0.5；MgSO4.7H2O 0.5；Cocl2 0.003； FeSO4 .7H2O 0.0075；ZnSO4 0.002； pH5~6。 四．实验方法： 1．还原糖的测定 （1）标准曲线的制作 取 9 支干燥试管，编号，按下表所示的量，精确浓度为 1.00 mg/ml 的葡萄糖标准液和 3， 5－二硝基水杨酸试剂。表中单位为 ml。 表 1 还原糖标准曲线制作 管号 加入试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.4 0 培养时间（h） OD600 值 0
3、5－二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3 3 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热 5 min，立即用冷水冷水冷却至室温，再向 各管中加入蒸馏水至 20.5 ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。 在 540 nm 波长下，以 0 号管为空白，在分光光度计上测定 1－8 号管的吸光度值。以吸光度 值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 （2）发酵液中残留还原糖的测定 发酵液单层滤纸过滤，滤液 0.2 ml 定容至 100 ml，500 倍稀释至含糖量 2-8 mg/100ml 为试样。 取 4 支干燥试管,编号,按表 2 所示的量,精确加入待测液和试剂(ml) 表 2 还原糖的测定 管号 项目 空白 还原糖 0 1 2 3 样品量 0 2.0 2.0 2.0 蒸馏水 2.0 0 0 0 3、5－二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 加完试剂后,其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同,测定出各管溶液 的吸光度值。 （3）计算 以管 1、2、3 的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数， 按下式计算样品中还原糖的百分含量： 2．氨基态氮的测定 （1）取发酵滤液 5.00 ml，置于 100 ml 烧杯中，加入 15 ml 水，磁力搅拌器搅拌 5 min 后， 将电位计插入烧杯中，用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至酸度计指示 pH=8.20，此为游离 酸度，不予计量。加入 10.0 ml 甲醛溶液，立即混匀，速用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至 酸度计指示 pH=9.20，计下消耗 NaOH 标准溶液的毫升数。同时用水做空白实验。 （2）计算 氨基氮（%）=（V-V0）×N×0.014× 20/5×100 式中： V——加甲醛后试液消耗氢氧化钠体积，ml; V0——加甲醛后空白液消耗氢氧化钠体积，ml; M—— NaOH 标准溶液的浓度,mol/L； 0.014——与 1.00mlNaOH 标准溶液相当的氮的质量，g； （3）淀粉酶活力的测定及计算： CK 样品 1 样品 2 样品 3 底物（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液（mL） 0 0.5 0.5 0.5 沸水浴 10min DNS（mL） 3 3 3 3 酶液（mL） 0.5 0 0 0 蒸馏水 加蒸馏水至 20. 5mL
3、5－二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3 3 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热 5 min，立即用冷水冷水冷却至室温，再向 各管中加入蒸馏水至 20.5 ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。 在 540 nm 波长下，以 0 号管为空白，在分光光度计上测定 1－8 号管的吸光度值。以吸光度 值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 （2）发酵液中残留还原糖的测定 发酵液单层滤纸过滤，滤液 0.2 ml 定容至 100 ml，500 倍稀释至含糖量 2-8 mg/100ml 为试样。 取 4 支干燥试管,编号,按表 2 所示的量,精确加入待测液和试剂(ml) 表 2 还原糖的测定 管号 项目 空白 还原糖 0 1 2 3 样品量 0 2.0 2.0 2.0 蒸馏水 2.0 0 0 0 3、5－二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 加完试剂后,其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同,测定出各管溶液 的吸光度值。 （3）计算 以管 1、2、3 的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数， 按下式计算样品中还原糖的百分含量： 2．氨基态氮的测定 （1）取发酵滤液 5.00 ml，置于 100 ml 烧杯中，加入 15 ml 水，磁力搅拌器搅拌 5 min 后， 将电位计插入烧杯中，用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至酸度计指示 pH=8.20，此为游离 酸度，不予计量。加入 10.0 ml 甲醛溶液，立即混匀，速用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至 酸度计指示 pH=9.20，计下消耗 NaOH 标准溶液的毫升数。同时用水做空白实验。 （2）计算 氨基氮（%）=（V-V0）×N×0.014× 20/5×100 式中： V——加甲醛后试液消耗氢氧化钠体积，ml; V0——加甲醛后空白液消耗氢氧化钠体积，ml; M—— NaOH 标准溶液的浓度,mol/L； 0.014——与 1.00mlNaOH 标准溶液相当的氮的质量，g； （3）淀粉酶活力的测定及计算： CK 样品 1 样品 2 样品 3 底物（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液（mL） 0 0.5 0.5 0.5 沸水浴 10min DNS（mL） 3 3 3 3 酶液（mL） 0.5 0 0 0 蒸馏水 加蒸馏水至 20. 5mL
550nm 处测 OD 值 OD1 OD2 OD3 淀粉酶活力（IU/g 干培养基）：本实验条件下，每分钟释放出 1umol 还原糖所需要的酶量称为一 个酶活力单位。 IU/g 干培养基＝ * *1000* * * OD n v k M t 其中：n――稀释倍数；v――浸提比（mL/g 干培养基）； k――斜率；M――葡萄糖的分子量； t――反应时间（10min）；1000――转换系数 五．操作步骤： 1．配制培养基，灭菌，冷却。 2．冷却后接种，并搅拌 均匀，置于 28℃培养箱进行培养。 3．每隔 24h 取样，用 0.2M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）按一定的浸提比 进行浸提 1h，离心得粗酶液。共取样 6 次。 4．分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。 六．实验结果： 1．以还原糖浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间还原糖的变化曲线。 2．以氨基态氮浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间氨基态氮的变化曲线。 3．以淀粉酶活力为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。 七．思考题 1、测定淀粉酶可采用哪些方法？ 2、比较固态发酵和液态发酵异同点。 实验六 小型连续发酵实验 一．实验目的 0 0 0 培养时间（h） 还原糖 （mg/mL） 培养时间（h） 氨基态氮 （mg/mL） 培养时间（h） 淀粉酶活力 （ IU/g 干培养基 ）
550nm 处测 OD 值 OD1 OD2 OD3 淀粉酶活力（IU/g 干培养基）：本实验条件下，每分钟释放出 1umol 还原糖所需要的酶量称为一 个酶活力单位。 IU/g 干培养基＝ * *1000* * * OD n v k M t 其中：n――稀释倍数；v――浸提比（mL/g 干培养基）； k――斜率；M――葡萄糖的分子量； t――反应时间（10min）；1000――转换系数 五．操作步骤： 1．配制培养基，灭菌，冷却。 2．冷却后接种，并搅拌 均匀，置于 28℃培养箱进行培养。 3．每隔 24h 取样，用 0.2M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）按一定的浸提比 进行浸提 1h，离心得粗酶液。共取样 6 次。 4．分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。 六．实验结果： 1．以还原糖浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间还原糖的变化曲线。 2．以氨基态氮浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间氨基态氮的变化曲线。 3．以淀粉酶活力为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。 七．思考题 1、测定淀粉酶可采用哪些方法？ 2、比较固态发酵和液态发酵异同点。 实验六 小型连续发酵实验 一．实验目的 0 0 0 培养时间（h） 还原糖 （mg/mL） 培养时间（h） 氨基态氮 （mg/mL） 培养时间（h） 淀粉酶活力 （ IU/g 干培养基 ）
学习组建微生物连续发酵装置，掌握连续发酵的操作原理和方法，运用所学的连续培养 知识求算发酵过程的稀释率。 二．基本原理 在分批培养中，一次加入所有的培养基，不予补充，不再更换。随着微生物的活跃生长， 培养基中营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，细菌的对数生长期不可长时间维持。 如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及 代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流出量能使分裂繁殖增加 的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变。连续培养方法的出现， 不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产 效益和自动化水平。此法已成为当前发酵工业的发展方向。 三、菌种与培养基 1、菌种：大肠杆菌（E. coli）； 2、培养基(g/L) 基本培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。培养 8h 后接入发酵培养基培养或 4℃冰箱保藏。 发酵培养基：葡萄糖 2g/L，Nacl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调 pH 至 7.2。 四、简单连续培养装置 图 1 简单连续培养装置 1－培养基贮槽 2－流出液接受器 3－蠕动泵 4－恒温水浴 5－磁力搅拌器 6－ 培养槽中搅拌转子 7－温度调节器 8－培养基加入管 9－培养液流出量 10－输送管 五．测定方法 1．还原糖的测定：3，5－二硝基水杨酸比色法测定 2．蛋白质浓度的测定：考马斯亮蓝染色法 3．大肠杆菌的增殖曲线测定（具体操作步骤见实验四） 大肠杆菌接种于母种培养基，在 37℃培养 6h，将培养液在 3000rpm 离心 10min，倾去 上清液，加入无菌的生理盐水，成均匀液，细胞数为 107 个/ml，接种于发酵培养基，在相 同条件下进行培养，并每隔一定时间进行取样，用无菌的相同培养液作为 CK，将上述菌液 于 600nm 波长比色（要求消光度在 0.3－0.6 间，如果超过用未接种的培养液适当稀释），然 后将培养液在红外线烘箱 110－120℃内烘干至恒重，以菌悬液 OD 值为纵坐标，相对应的 菌体浓度为横坐标，绘制直线，求出斜率 1/K。 K＝生物量/OD 值
学习组建微生物连续发酵装置，掌握连续发酵的操作原理和方法，运用所学的连续培养 知识求算发酵过程的稀释率。 二．基本原理 在分批培养中，一次加入所有的培养基，不予补充，不再更换。随着微生物的活跃生长， 培养基中营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，细菌的对数生长期不可长时间维持。 如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及 代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流出量能使分裂繁殖增加 的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变。连续培养方法的出现， 不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产 效益和自动化水平。此法已成为当前发酵工业的发展方向。 三、菌种与培养基 1、菌种：大肠杆菌（E. coli）； 2、培养基(g/L) 基本培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。培养 8h 后接入发酵培养基培养或 4℃冰箱保藏。 发酵培养基：葡萄糖 2g/L，Nacl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调 pH 至 7.2。 四、简单连续培养装置 图 1 简单连续培养装置 1－培养基贮槽 2－流出液接受器 3－蠕动泵 4－恒温水浴 5－磁力搅拌器 6－ 培养槽中搅拌转子 7－温度调节器 8－培养基加入管 9－培养液流出量 10－输送管 五．测定方法 1．还原糖的测定：3，5－二硝基水杨酸比色法测定 2．蛋白质浓度的测定：考马斯亮蓝染色法 3．大肠杆菌的增殖曲线测定（具体操作步骤见实验四） 大肠杆菌接种于母种培养基，在 37℃培养 6h，将培养液在 3000rpm 离心 10min，倾去 上清液，加入无菌的生理盐水，成均匀液，细胞数为 107 个/ml，接种于发酵培养基，在相 同条件下进行培养，并每隔一定时间进行取样，用无菌的相同培养液作为 CK，将上述菌液 于 600nm 波长比色（要求消光度在 0.3－0.6 间，如果超过用未接种的培养液适当稀释），然 后将培养液在红外线烘箱 110－120℃内烘干至恒重，以菌悬液 OD 值为纵坐标，相对应的 菌体浓度为横坐标，绘制直线，求出斜率 1/K。 K＝生物量/OD 值