实验一动物性食品微生物学检验 [实验目的]掌握动物性食品中菌落总数、大肠菌群测定和沙门氏菌检验的程序、操作 步骤和结果报告，熟悉检测项目的基本原理及卫生学意义。 一、动物性食品中菌落总数的测定 菌落总数(Aerobic plate coun)是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基 培养温度和培养时间等)培养后，所得每g(mL)检样中形成的微生物菌落总数。菌落计 数以菌落形成单位(colony-forming units,CFU)表示。 每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其它生理条件（如 温度，培养时间， ,需氧性质等)去满足其需求 才能分别将各种细都培养出来， 实际工作 中，菌落 是以检 细 和平权 数琼脂混 在37C有 条件下培养，米测定样品中的菌落总数，所得结果只包括一群在平板计数琼脂中发育的嗜 中温性需氧和兼性厌氧细菌的菌落总数。 菌落总数的增多和食品的变质常有一定的联系，但和食品安全性不一定相关。菌落总数 主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以 及细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供 学低 。木实哈中 落总数测定按GB4789,2一2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进 行。 1.设备和材料除微生物实验室常规灭南及培养设备外，其他设备和材料如下： (1)恒温培养箱36C±1℃，30℃±1℃。 (2)冰箱.2℃5℃ (3)恒温水浴箱：46C±1℃。 (4)天平：感量为0.1g (5)均质器或灭菌乳体。 (6)振荡器。 7)无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10ml(具0.1ml刻度)或微量移液器 及吸头 (8)无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。 (9)无菌培养皿：直径90mm。 (1O)pH计或pH比色管或精密pH试纸。 (11)放大镜或/和菌落计数器。 (12)灭菌刀、剪子 (13)放大镜或/和菌落计数器。 (14)灭菌玻璃珠：直径为5mm。 2.培养基和试剂 (1)平板计数琼脂培养基 ①成分：胰蛋白胨5.0g,酵母浸膏2.5g,葡萄糖1.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1000 mL, H70402 ②制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节H。分装试管或锥形瓶，121℃ 高压灭菌15min
实验一 动物性食品微生物学检验 [实验目的] 掌握动物性食品中菌落总数、大肠菌群测定和沙门氏菌检验的程序、操作 步骤和结果报告，熟悉检测项目的基本原理及卫生学意义。 一、动物性食品中菌落总数的测定 菌落总数（Aerobic plate count）是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、 培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。菌落计 数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其它生理条件（如 温度，培养时间，pH，需氧性质等）去满足其需求，才能分别将各种细菌都培养出来。但 实际工作中，菌落总数测定，是以检样中的细菌细胞和平板计数琼脂混合后，在 37℃有氧 条件下培养，来测定样品中的菌落总数，所得结果只包括一群在平板计数琼脂中发育的嗜 中温性需氧和兼性厌氧细菌的菌落总数。 菌落总数的增多和食品的变质常有一定的联系，但和食品安全性不一定相关。菌落总数 主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以 及细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。本实验中菌 落总数测定按 GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进 行。 1. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）恒温培养箱 36℃±1℃，30℃±1℃。 （2）冰箱：2℃～5℃。 （3）恒温水浴箱：46℃±1℃。 （4）天平：感量为0.1 g。 （5）均质器或灭菌乳钵。 （6）振荡器。 （7）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器 及吸头。 （8）无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。 （9）无菌培养皿：直径90 mm。 （10）pH计或pH比色管或精密pH试纸。 （11）放大镜或/和菌落计数器。 （12）灭菌刀、剪子、镊子等。 （13）放大镜或/和菌落计数器。 （14）灭菌玻璃珠：直径为 5 mm。 2. 培养基和试剂 （1）平板计数琼脂培养基 ① 成分：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0±0.2。 ② 制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121℃ 高压灭菌15 min
(2)磷酸盐缓冲液 ①成分：无菌磷酸二氢钾(KHPO4)34.0g,蒸馏水500mL,pH7.2。 ②制法 a.贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用1molL氢氧化钠溶液调 节pH7.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。 b.稀释液：取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中，121℃ 高压灭菌15min (3)无菌生理盐水 ①成分：氯化钠85g,蒸馏水1000mL。 2制法：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。 菌落总数的检验程序见图111。 稀释液，均质 10倍系列稀释 每皿中加入15~20ml平板计数琼脂培养基，混匀 36℃1℃，48h2h,培养 计数各平板菌落数 计算菌落总数 报告 图1-1-1荫落总数的检验程序 3.操作步骤 (1)样品的稀释及培养 ①固体和半固体样品：称取25g样品置盛有25mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均 质杯内，8000~10000 r/min均质1min~2min,或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1：10的样品匀液。 ②液体样品：以无南吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。 ③用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9ml 稀释液的无菌试管 (注意吸管或吸头 端不 要触及稀释液面)，振据试管或换用1支无菌 吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液
（2）磷酸盐缓冲液 ① 成分：无菌磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0 g，蒸馏水 500 mL，pH 7.2。 ② 制法： a. 贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用1 mol/L氢氧化钠溶液调 节pH7.2，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。 b. 稀释液：取贮存液 1.25 mL，用蒸馏水稀释至 1 000 mL，分装于适宜容器中，121℃ 高压灭菌 15 min。 （3）无菌生理盐水 ①成分：氯化钠 8.5 g，蒸馏水 1 000 mL。 ②制法：称取 8.5ｇ氯化钠溶于 1 000 mL 蒸馏水中，121℃高压灭菌 15 min。 菌落总数的检验程序见图 1-1-1。 图 1-1-1 菌落总数的检验程序 3. 操作步骤 （1）样品的稀释及培养 ① 固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均 质杯内，8 000～10 000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。 ② 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 ③ 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌 吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 选择 2～3个适宜稀释度的样品匀液，各 取 1 mL分别加入无菌培养皿内 每皿中加入 15～20 mL平板计数琼脂培养基，混匀 36℃±1℃，48h±2h，培养 计数各平板菌落数 计算菌落总数 报告 检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质 10 倍系列稀释
④另取1mL无菌吸管或微量移液器，按上条操作方法，做10倍系列稀释液。每递增 稀释一次，换用1次1L无菌吸管或吸头。 ⑤根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包 括原液)，在进行10倍递增稀释时， 吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个 平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 ®稀释液移入平皿后，及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可 放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)领注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 ⑦待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48ht2h。水产品30℃±1℃培养 72ht3h。如果样品中 可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时 可在凝固后的琼脂表 面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL),凝固后翻转平板，进行培养 (2)菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应 的菌落数量。 ①洗取菌落数在30CFU一300CF之间、无莓征菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30C℉U的平板记录具体菌落数，大于300C℉U的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数 应采用两个平板的平均数 ②其中 个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板 作为该稀释度的菌落数：若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 ③当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 (3)结果与报生 ①菌落总数的计算方法 a.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均 值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中菌落总数结果（表1-1-2中例 b.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(1-1-1)计算 N= (1-1-1) (n +0.In,d 式中： 一样品中南落数 EC- 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和 稀释度（低稀释倍数）平板个数： 第二稀释度（高稀释倍数）平板个数： d一稀释因子（第一稀释度）。 表111两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时的示例 稀释度 1:100(第一稀释度) 1:1000(第二稀释度) 菌落数(CFU) 232,244 33,35 232+244+33+35 = 544 =24727 2+0.1×2102 0.022 上述数据修约后，表示为25000或2.5×10。 c.若所有稀释度的平板上茵落数均大于300C℉U,则对稀释度最高的平板进行计数， 其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算（表1-12中例 2)
④ 另取1 mL无菌吸管或微量移液器，按上条操作方法，做10倍系列稀释液。每递增 稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头。 ⑤ 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包 括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个 平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 ⑥ 稀释液移入平皿后，及时将15 mL～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可 放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 ⑦ 待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养 48h±2 h。水产品 30℃±1℃培养 72h±3 h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表 面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，进行培养。 （2）菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应 的菌落数量。 ① 选取菌落数在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数 应采用两个平板的平均数。 ② 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板 作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 ③ 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 （3）结果与报告 ① 菌落总数的计算方法 a. 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均 值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果（表1-1-2中例 1）。 b. 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（1-1-1）计算： n n d C N 1 2 0.1 （1-1-1） 式中：N——样品中菌落数； ∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。 表 1-1-1 两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时的示例 稀释度 1:100（第一稀释度） 1:1000（第二稀释度） 菌落数（CFU） 232，244 33，35 上述数据修约后，表示为 25 000 或 2.5×104。 c. 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数， 其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算（表1-1-2中例 2）。 N= 232+244+33+35 [2+(0.1×2)]10-2 = 544 0.022 =24727
d.若所有稀释度的平板菌落数均小于30C℉U,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数计算（表12中例3） 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释 倍数计算（表1-12中例4）。 E若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300C℉U之间，其中一部分小于30C℉U 或大于300C℉U时，则以最接近30CFU或300C℉U的平均菌落数乘以稀释倍数计算（表1- 1-2中例5)。 ②菌落总数的报告（表112报告方式”栏）： a.菌落数小于100C℉U时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 b.菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用四舍五入"”原则修约后，取前2位数 字，后面用0代替位数：也可用10的指数形式来表示，按四舍五入”原则修约后，采用两位 有效数字。 c.若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延 d若空白X 照上有菌落生长， 则此次检测结果无效 e.称重取样以CFUg为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。 表1-12稀释度选择及菊落数报告方式 稀释液及两平板菌落平均数 例次 10-1 102 103 菌落总数MCFU/g(mL】 报告方式CFU/gmL】 1 多不可计 16d 20 16400 16000或1.6x10 2 多不可计 多不可计 33 313000 310000或3.1×10 27 270 270或2.7x102 4 0 0 <1x10 <10 多不可计 305 12 30500 31000或3.1×10 一、动物件食品中大场菌群的测 大肠菌群(Coliforms)是在一定培养条件下能发酵到糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧 革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群不是细菌学上的分类命名，不是指某 种特定的细菌 而是根邦 卫生学方面的要求，提出来的一群与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血 清学方面并非完全一致，其定义为，这一群细菌包括埃希氏南属，枸椽酸菌属，肠杆南属 (又叫产气杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌)、克雷伯氏菌属中的一部分和沙门氏菌 属的第Ⅱ亚属（能发酵乳糖）的细菌。 一般认为，大肠菌群都是直接或间接来自人与温血动物的的粪便，从食品中检出大肠 菌群既表示食品曾受到人或 血动物粪便的污染，因此大肠菌群作为粪便污染指标菌而衫 提出米。食品中检出大肠菌群的细菌，表明该食品有粪便污染，既有粪便污染。就可能有 肠道致病菌的存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。 GB4789.3一2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中规定的食品 大肠菌群计数的方法有大肠菌群MP计数法和大肠菌群平板计数法两种方法，可根据检测 的需要选择采用。 大肠菌群MPN(Most probabl MPN)是指每g(mL)检样内所 含大肠菌群的最可能数（表1-2-1），是基于泊松分布的一种间接计数方法。 注：我国以前的食品卫生国家标准中MPN是指每100g(mL)检样内所含大肠菌群的最可能数 MPN/T1OOg(mL)],因此，在引用食品卫生国家标准时，要注意与食品安全国家标准中的MPNAg(mL)】
d. 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数计算（表1-1-2中例3）。 e. 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释 倍数计算（表1-1-2中例4）。 f.若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU 或大于 300 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算（表1- 1-2中例5）。 ② 菌落总数的报告（表1-1-2报告方式”栏）： a. 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 b. 菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数 字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位 有效数字。 c. 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 d. 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 e. 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。 表1-1-2 稀释度选择及菌落数报告方式 例次 稀释液及两平板菌落平均数 菌落总数/[CFU/g(mL)] 报告方式/[CFU/g(mL)] 10-1 10-2 10-3 1 多不可计 164 20 16400 16000或1.6×104 2 多不可计 多不可计 313 313000 310000或3.1×105 3 27 11 5 270 270或2.7×102 4 0 0 0 ＜1×10 ＜10 5 多不可计 305 12 30500 31000或3.1×104 二、动物性食品中大肠菌群的测定 大肠菌群（Coliforms）是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧 革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群不是细菌学上的分类命名，不是指某一种特定的细菌， 而是根据卫生学方面的要求，提出来的一群与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血 清学方面并非完全一致，其定义为，这一群细菌包括埃希氏菌属，枸椽酸菌属，肠杆菌属 （又叫产气杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）、克雷伯氏菌属中的一部分和沙门氏菌 属的第Ⅲ亚属（能发酵乳糖）的细菌。 —般认为，大肠菌群都是直接或间接来自人与温血动物的的粪便，从食品中检出大肠 菌群既表示食品曾受到人或温血动物粪便的污染，因此大肠菌群作为粪便污染指标菌而被 提出来。食品中检出大肠菌群的细菌，表明该食品有粪便污染，既有粪便污染．就可能有 肠道致病菌的存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。 GB4789.3—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中规定的食品 大肠菌群计数的方法有大肠菌群 MPN 计数法和大肠菌群平板计数法两种方法，可根据检测 的需要选择采用。大肠菌群 MPN（Most probable number，MPN）是指每 g（mL）检样内所 含大肠菌群的最可能数（表 1-2-1），是基于泊松分布的一种间接计数方法。 注：我国以前的食品卫生国家标准中 MPN 是指每 100g（mL）检样内所含大肠菌群的最可能数 MPN/[100g（mL）]，因此，在引用食品卫生国家标准时，要注意与食品安全国家标准中的 MPN/[g（mL）]
相区别。 1.设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： (1)恒温培养箱：36C±1℃。 (2)冰箱：20 ~5℃ (3)恒温水浴箱：46C±1℃ (4)天平：感量为0.1g。 (5)均质器。 (6)拒熙 (7)无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及 吸头。 (8)无菌维形瓶：容量250mL、500mL (9)无菌培养皿：直径90mm。 (10)灭菌玻璃珠：直径为5mm (1)pH计或H比色管或精密pH试纸 (12)灭菌刀、剪子、镊子等 (13)菌落计数器。 2.培养基和试剂 (1)月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤 ①成分：蛋白陈或胰酪陈200g,氯化钠50g,乳糖5.0g酸氢二钾(K:HPO,) 275g酸 与细 KH,P04)2.75g,月桂基硫酸钠0.1g,蒸馏水1000ml ②制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管 中，每管10mL。121℃高压灭菌15min. (2)煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤 ①成分：蛋白胨10.0g,乳糖10.0g,牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200mL,0.1%煌 绿水溶液13.3ml 800m ②制法：将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g 脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0~7.5)，用蒸馏水稀释到975mL,调节 pH72士0.1，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL,用燕馏水补足到1000mL,用棉花过滤后， 分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。 (3)结品紫中性红胆盐琼脂(VRBA) ①成分：蛋白胨7.0g,酵母音3.0g,乳糖10.0g,氯化钠5.0g,胆盐或3号胆盐1.5g, 中性红0.03g,结晶紫0.002g,琼脂15g~18g,蒸馏水1000mL。 ②制法：将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH7.40.1。煮沸2 mim,将培养基冷却至45C~50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。 (4)磷酸盐缓冲液见菌落总数的测定中磷酸盐缓冲液的配制方法。 (5)无菌生理盐 见菌落总数的测定中无菌生理盐水的配制方法 (6)I mol/L NaOH ①成分：NaOH40.0g,蒸馏水1000mL。 ②制法：称取40.0g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。 (7)Imol/LHCI ①成分：浓盐酸90mL,蒸馏水1000m ②制法：移取浓盐酸90mL,用蒸馏水稀释至1000mL,121C高压灭菌15mim。 (8)革兰氏染液 ①结晶紫染色液：结晶紫1.0g,95%乙醇20mL,1%草酸铵水溶液80mL
相区别。 1. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）恒温培养箱：36℃±1℃。 （2）冰箱：2℃～5℃。 （3）恒温水浴箱：46℃±1℃。 （4）天平：感量为0.1 g。 （5）均质器。 （6）振荡器。 （7）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及 吸头。 （8）无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。 （9）无菌培养皿：直径90 mm。 （10）灭菌玻璃珠：直径为5 mm。 （11）pH计或pH比色管或精密pH 试纸。 （12）灭菌刀、剪子、镊子等。 （13）菌落计数器。 2. 培养基和试剂 （1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 ① 成分：胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g，氯化钠5.0 g，乳糖5.0 g，磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75 g，月桂基硫酸钠0.1 g，蒸馏水1 000 mL。 ② 制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管 中，每管10 mL。121℃高压灭菌15 min。 （2）煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 ① 成分：蛋白胨10.0 g，乳糖10.0 g，牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200 mL，0.1%煌 绿水溶液13.3 mL，蒸馏水800 mL。 ② 制法：将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将20.0 g 脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节 pH7.2±0.1，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL，用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后， 分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121℃高压灭菌15 min。 （3）结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） ① 成分：蛋白胨7.0 g，酵母膏3.0 g，乳糖10.0 g，氯化钠5.0 g，胆盐或3号胆盐1.5 g， 中性红0.03 g，结晶紫0.002 g，琼脂 15 g～18 g，蒸馏水1 000 mL。 ② 制法：将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH 7.4±0.1。煮沸2 min，将培养基冷却至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3 h。 （4）磷酸盐缓冲液 见菌落总数的测定中磷酸盐缓冲液的配制方法。 （5）无菌生理盐水 见菌落总数的测定中无菌生理盐水的配制方法。 （6）1 mol/L NaOH ① 成分：NaOH 40.0 g，蒸馏水1 000 mL。 ② 制法：称取 40.0 g 氢氧化钠溶于 1 000 mL 蒸馏水中，121℃高压灭菌 15 min。 （7）1 mol/LHCl ① 成分：浓盐酸90 mL，蒸馏水1 000 mL ② 制法：移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，121℃高压灭菌15 min。 （8）革兰氏染液 ① 结晶紫染色液：结晶紫 1.0 g，95%乙醇 20 mL，1%草酸铵水溶液 80 mL
将结品紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 ②革兰氏碘液：碘1.0g,碘化钾20g 荒水300m. 将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振荡，待完全溶解后，再加入蒸馆 水至300mL ③沙黄复染液：沙黄0.25g,95%乙醇10mL,燕馏水90mL。将沙黄溶于乙醇中， 然后再用蒸馏水稀释。 (一)大肠菌群MPN计数法（第一法） 大肠菌群MPN计数法的检验程序见图12-1。 1.操作步骤 (1)检样稀释 ①固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均 质杯内，8000-10000rmin均质1min-2min.或放入盛有225mL稀释液的无南均质袋 中，用拍击式均质器拍打1mm ②液体样品： 以无菌 菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无南玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。 ③样品匀液的pH应在6.5~7.5之间，必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HC1调 节。 ④用1mL无南吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀 释液的无茵试管中( 注意吸管或吸头尖端不触及稀释液面) ,振摇试管或换用1支无菌吸 管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液 ⑤另取1mL无菌吸管或微量移液器，按上条操作方法，做10倍系列稀释液。每递增稀 释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。 (2)初发酵试验：根据对检样污染状况的估计，洗择3个活官稀释度的样品匀液（液 体样品可以选择原液) 每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤，每管 (如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤)，36C±1C培养2 h2h,观察倒管内是 否有气泡产生，24h2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h+2h,产气者进 行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 (3)复发酵试验：用接种环从产气的ST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳 糖胆盐肉汤(BGLB)管中，36℃±1℃培养482h,观察产气情况。产气者，计为大肠菌 群阳性管 (4)大肠菌群最可能数(MPN)的报告：按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN 表（表1-2-1），报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPW值
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 ② 革兰氏碘液：碘 1.0 g，碘化钾 2.0 g，蒸馏水 300 mL。 将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振荡，待完全溶解后，再加入蒸馏 水至 300 mL。 ③ 沙黄复染液：沙黄 0.25 g，95%乙醇 10 mL，蒸馏水 90 mL。将沙黄溶于乙醇中， 然后再用蒸馏水稀释。 （一）大肠菌群MPN计数法（第一法） 大肠菌群MPN计数法的检验程序见图1-2-1。 1. 操作步骤 （1）检样稀释 ① 固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均 质杯内，8 000～10 000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。 ② 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 ③ 样品匀液的pH 应在6.5～7.5之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调 节。 ④ 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀 释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸 管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 ⑤ 另取1mL无菌吸管或微量移液器，按上条操作方法，做10倍系列稀释液。每递增稀 释一次，换用1次1 mL 无菌吸管或吸头。 （2）初发酵试验：根据对检样污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液（液 体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接 种1 mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是 否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进 行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 （3）复发酵试验：用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳 糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌 群阳性管。 （4）大肠菌群最可能数（MPN）的报告：按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN 表（表1-2-1），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值
25g(mL样品+225mL稀释液，均质 10倍系列稀释 选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管 36C±1℃48d2h 不产气 产气 GLB肉汤 36℃±1℃4gh42 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 查MPN表 报告结果 图1-21大肠菌群MPN计数法检验程序 (二)大肠菌群平板计数法（第二法） 大肠菌群平板计数法的检验程序见图1-2-2。 L.操作步骤 (1)样品的稀释：按大肠菌群MPN计数法进行。 (2)平板计数 ①根据对检样污染状况的估计，选取2一3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个 无菌平皿，每皿1ml。同时取1L生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 ②及时将15mL~20mL冷至46C±1℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL一4mL VRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36C±1C培养18h~24h。 (3)平板菌落数的选择：选取菌落数在15C℉U~150C℉U之间的 ，分别计数平 上出现的典型可聚大肠菌商家·臭面客为紫红色，菌陈周同有红色的测盖沉淀不 菌落直径为0.5mm或更大。 (4)证实试验：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报 为大肠菌群阳性 (5)大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的 板典型和可疑菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例如，10样 品稀释液1mL,在VRBA平板上有1O0个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤
（二）大肠菌群平板计数法（第二法） 大肠菌群平板计数法的检验程序见图 1-2-2。 1. 操作步骤 （1）样品的稀释：按大肠菌群MPN计数法进行。 （2）平板计数 ① 根据对检样污染状况的估计，选取2～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个 无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 ② 及时将15 mL～20 mL冷至46℃±1℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mL VRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18 h～24 h。 （3）平板菌落数的选择：选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板 上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环， 菌落直径为0.5 mm或更大。 （4）证实试验：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报 告为大肠菌群阳性。 （5）大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平 板典型和可疑菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例如，10-4样 品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤 检 样 25 g (mL)样品+225 mL 稀释液，均质 10 倍系列稀释 选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管 36℃±1℃ 产气 BGLB 肉汤 不产气 产 气 48h±2h 不产气 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 查 MPN 表 报告结果 36℃±1℃ 48h±2h 图1-2-1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序
管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10x10g(mL)=6.0×10CFUg (mL) 10倍系列稀释 选择2一3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA平板 36℃1℃18h~24h 计数典型和可疑菌落 BGLB肉汤 36c+124h-48 报告结果 图12-2大肠菌群平板计数法检验程序 表1-21大肠菌群最可能数(MPN)检索表 阳性管 95%可信限 0.10 0.001 MPN 0.01 下限 上限 0 0 0 9.5 0 0 0 015 3 0 0 18 0 0 1 0 88 1 0 0 7.4 613 2 1 11 ( 562 2 66515455 2 2 2 405022 8222582222424 22 35 87
管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104 /g（mL）=6.0×105CFU/g （mL）。 、 表 1-2-1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 MPN 95%可信限 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0 0 0 <3.0 — 9.5 0 0 1 3.0 0.15 9.6 0 1 0 3.0 0.15 11 0 1 1 6.1 1.2 18 0 2 0 6.2 1.2 18 0 3 0 9.4 3.6 38 1 0 0 3.6 0.17 18 1 0 1 7.2 1.3 18 1 0 2 11 3.6 38 1 1 0 7.4 1.3 20 1 1 1 11 3.6 38 1 2 0 11 3.6 42 1 2 1 15 4.5 42 1 3 0 16 4.5 42 2 0 0 9.2 1.4 38 2 0 1 14 3.6 42 2 0 2 20 4.5 42 2 1 0 15 3.7 42 2 1 1 20 4.5 42 2 1 2 27 8.7 94 2 2 0 21 4.5 42 2 2 1 28 8.7 94 2 2 2 35 8.7 94 检 样 25 g(mL)样品+225mL 稀释液,均质 10 倍系列稀释 选择 2～3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA平板 36℃±1℃ 计数典型和可疑菌落 BGLB 肉汤 报告结果 18h～24h 36℃±1℃ 24h～48h 图 1-2-2 大肠菌群平板计数法检验程序
3 0 29 8.7 3 36 8 、2 0 46 3 3 64 17 3 0 9 120 3 3 160 0 9 18 420 150 37 420 210 40 430 290 1.00 3 0 240 42 1.0m 3 3 46n 3.000 3 1100 180 4,100 >1100 420 注：①本表采用3个稀释度0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001gmlL小，每个稀释度接种3管.②表内 所列检样量如政用g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时。 表内数 应相应降低10倍：如改用001g(mL) 0.001g(ml、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。 三、动物性食品中沙门氏菌的检验 沙门氏菌属(Salmor ell@)是肠杆菌科的一个大属，也是肠杆菌科中最重要的病原菌属，沙 门氏菌屈(Salmonella)为肠杆菌科中的一个大属，仅包括2个种，即肠道沙门氏南(S.enterica) 和博恩格律沙门氏菌(S.bongori)。引起人和食品动物发生感染最常见的属于肠道亚种。沙 门氏菌约有2000多个血清型和变种，我国已发现120多个血清型。本属细菌绝大多数成员 对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与目肠炎，其至流产，并能引起人类食物中 毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原茵之 世界各地的食物中毒病例中，英国、中国 沙门氏菌食物中毒居首位，美国沙门氏菌食物中毒居第二位。沙门氏菌常作为食品致病菌指 标。食品中沙门氏菌检验按GB4789.4一2010《食品安全国家标淮食品微生物学检验沙门 氏菌检验》进行。 1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设各外，其他设备和材料如下： (2)恒温培养箱：36C±1C,42℃±1℃ (3)均质器。 (4)振荡器。 (5)电子天平：感量01g (6)无菌锥形瓶：容量500mL,250mL (7)无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及 吸头 (8)无菌培养皿：直径90mm。 (9)无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。 (10)无南毛细管。 (II)pH计或pH比色管或精密pH试纸。 (12)全自动微生物生化鉴定系统
2 3 0 29 8.7 94 2 3 1 36 8.7 94 3 0 0 23 4.6 94 3 0 1 38 8.7 110 3 0 2 64 17 180 3 1 0 43 9 180 3 1 1 75 17 200 3 1 2 120 37 420 3 1 3 160 40 420 3 2 0 93 18 420 3 2 1 150 37 420 3 2 2 210 40 430 3 2 3 290 90 1，000 3 3 0 240 42 1，000 3 3 1 460 90 2，000 3 3 2 1100 180 4，100 3 3 3 >1100 420 -- 注：①本表采用3个稀释度[0.1g (mL)、0.01 g (mL)和 0.001 g (mL)]，每个稀释度接种 3 管。②表内 所列检样量如改用lg（mL）、0.1 g (mL)和0.01g (mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用 0.01g (mL)、 0.001g (mL)、0.0001g (mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。 三、动物性食品中沙门氏菌的检验 沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科的一个大属，也是肠杆菌科中最重要的病原菌属，沙 门氏菌属（Salmonella）为肠杆菌科中的一个大属，仅包括 2 个种，即肠道沙门氏菌（S.enterica） 和博恩格律沙门氏菌（S.bongori）。引起人和食品动物发生感染最常见的属于肠道亚种。沙 门氏菌约有 2 000 多个血清型和变种，我国已发现 120 多个血清型。本属细菌绝大多数成员 对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中 毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一。世界各地的食物中毒病例中，英国、中国 沙门氏菌食物中毒居首位，美国沙门氏菌食物中毒居第二位。沙门氏菌常作为食品致病菌指 标。食品中沙门氏菌检验按 GB 4789.4—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门 氏菌检验》进行。 1. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）冰箱：2℃～4℃。 （2）恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 （3）均质器。 （4）振荡器。 （5）电子天平：感量0.1 g。 （6）无菌锥形瓶：容量500 mL，250 mL。 （7）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及 吸头。 （8）无菌培养皿：直径90 mm。 （9）无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。 （10）无菌毛细管。 （11）pH计或pH比色管或精密pH 试纸。 （12）全自动微生物生化鉴定系统
2.培养基和试剂 (1)缓冲蛋白胨水(BPW) ①成分 蛋白胨10.0g,氯化钠50g,磷酸氢二钠（含12个结晶水）90g,磷酸二氢 钾1.5g,蒸馏水1000mL。 ②制法：将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10mi,煮沸溶解，调节pH 7.240.2,高压灭菌121℃，15min。 (2)四流猫静钠煌绿(TTB)增菌液 ①基础液： 蛋白胨10.0g,牛肉音5.0g,氯化钠3.0g,碳酸钙45.0g, 蒸馏水1000 mL。除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调 pH7.0H02。,高压灭菌121℃，20min ②硫代硫酸钠溶液：硫代硫酸钠（含5个结品水）50.0g,蒸馏水加至100mL。高压 灭南121℃，20min。 ③曲溶液，曲片00。，化钾250。，蒸馏水加至100mL。将独化拥充分溶解干少 量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总 量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。 ④0.5%煌绿水溶液：煌绿0.5g,蒸馏水100mL,溶解后，存放暗处，不少于1天，使 其自然灭菌。 ⑤牛胆盐溶液：牛胆盐10.0g,蒸馏水100mL,加热煮沸至完全溶解，高压灭菌 121c,20mim ⑥制法：基础液900mL,硫代硫酸钠溶液100mL,碘溶液20.0mL,煌绿水溶液2.0 mL,牛胆盐溶液50.0mL。临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入 一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。 (3)亚晒酸盐胱氨酸(SC)增茵液 ①成分：蛋白胨5.0g,乳糖4.0g,磷酸氢二钠10.0g,亚硒酸氢钠4.0gL胱氨酸 0.01g蒸馏水1000ml ②制法：除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃ 以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1gLL-胱氨酸溶液10mL(称取0.1gL胱氨酸，加1 moM氢氧化钠溶液15mL,使溶解，再加无菌蒸馏水至1O0mL即成，如为DL-胱氨酸， 用量应加倍)。摇匀，调节p7.010.2。 (4)亚硫酸铋 (BS)琼脂 ①成分：蛋白胨10.0g,牛肉膏5.0g,葡萄糖5.0g,硫酸亚铁0.3g,磷酸氢二钠4.0 g,煌绿0.025g或5.0gL水溶液5.0mL,柠檬酸铋铵2.0g,亚硫酸纳6.0g,琼脂18.0g~20.0 g,蒸馏水1000mL。 ②制法：将前三种成分加入300mL.蒸馏水（制作基液），硫酸亚铁和磺酸氢二钠 分别加入20mL和30mL蒸馏水中，柠檬酸秘铵和亚硫酸钠分别加入另 20mL和30ml 蒸馏水中，琼脂加入600mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解 冷至80C左名 时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸秘铵和亚硫酸钠混 匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH7.50.2,随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃~ 55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。 注：①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其达择性，贮于室温暗处 超过48h会降低其选择性。②本培养基宜于当天制备，第2天使用 (5)E琼脂 ①成分：蛋白胨12.0g,牛肉膏3.0g,乳糖12.0g,燕糖12.0g,水杨素2.0g,胆盐 20.0g,氯化钠5.0g,琼脂18.0g~20.0g,蒸馏水1000mL,0.4%溴麝香草酚蓝溶液16.0
2. 培养基和试剂 （1）缓冲蛋白胨水（BPW） ① 成分：蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，磷酸氢二钠（含12个结晶水）9.0 g，磷酸二氢 钾1.5 g，蒸馏水1 000 mL。 ② 制法：将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH 7.2±0.2，高压灭菌121℃，15 min。 （2）四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 ① 基础液：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，氯化钠3.0 g，碳酸钙45.0 g，蒸馏水1 000 mL。除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节 pH7.0±0.2。，高压灭菌121℃，20 min。 ② 硫代硫酸钠溶液：硫代硫酸钠（含5个结晶水） 50.0 g，蒸馏水加至100 mL。高压 灭菌121℃，20 min。 ③ 碘溶液：碘片20.0 g，碘化钾25.0 g，蒸馏水加至100 mL。将碘化钾充分溶解于少 量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总 量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。 ④ 0.5％煌绿水溶液：煌绿0.5 g，蒸馏水100 mL，溶解后，存放暗处，不少于1天，使 其自然灭菌。 ⑤ 牛胆盐溶液：牛胆盐10.0 g，蒸馏水100 mL，加热煮沸至完全溶解，高压灭菌 121℃，20 min。 ⑥ 制法：基础液900 mL，硫代硫酸钠溶液100 mL，碘溶液20.0 mL，煌绿水溶液2.0 mL，牛胆盐溶液50.0 mL。临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入 一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。 （3）亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液 ① 成分：蛋白胨5.0 g，乳糖4.0 g，磷酸氢二钠10.0 g，亚硒酸氢钠4.0 g，L-胱氨酸 0.01 g，蒸馏水1 000 mL。 ② 制法：除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃ 以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1 g/L L-胱氨酸溶液10 mL（称取0.1 g L-胱氨酸，加1 mol/L 氢氧化钠溶液15 mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至100 mL 即成，如为DL-胱氨酸， 用量应加倍）。摇匀，调节pH 7.0±0.2。 （4）亚硫酸铋（BS）琼脂 ① 成分：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，葡萄糖5.0 g，硫酸亚铁0.3 g，磷酸氢二钠4.0 g，煌绿0.025 g或5.0 g/L水溶液5.0 mL，柠檬酸铋铵2.0 g，亚硫酸钠6.0 g，琼脂18.0 g～20.0 g，蒸馏水1 000 mL。 ② 制法：将前三种成分加入300 mL 蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠 分别加入20 mL和30 mL 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 20 mL和30 mL 蒸馏水中，琼脂加入600 mL 蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80℃左右 时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混 匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH 7.5±0.2，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃～ 55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。 注：①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处， 超过48 h 会降低其选择性。②本培养基宜于当天制备，第2天使用。 （5）HE 琼脂 ① 成分：蛋白胨12.0 g，牛肉膏3.0 g，乳糖12.0 g，蔗糖12.0 g，水杨素2 .0 g，胆盐 20.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂18.0 g～20.0 g，蒸馏水1 000 mL，0.4％溴麝香草酚蓝溶液16.0