江大学网络教育精品资源共享课 药物的杂质检查案例分析 药物的杂质检查是评价药物纯度的主要方面,特别是有关物质的检查,具有很强的针对 性,其与药物的生产工艺、结构特性密切相关。通过一般杂质和特殊杂质检查的案例分析, 熟悉如何根据合成工艺,药物的稳定性,选择适宜的检查方法、确立最佳测试条件和合理的 限量指标。 案例 药物中重金属检查方法和限度的确定 概述 重金属属于一般杂质,广泛存在于自然界中,其为有毒杂质,在体内易积蓄中毒,因此, 多数药物均要控制重金属限量。《中国药典》收载的品种中重金属限量多数控制在百万分之 五至百万分之二十之间。限量制定是否合理,关系到能否真正控制样品中重金属量,可通过 实验半定量方式进行确定。同时重金属可与某些环状结构的药物分子形成较牢固的价健,不 易被检岀,需采用炽灼破坏,使有机结合的重金属游离后,再依法检查。而一些药物难溶于 水、稀酸,使直接重金属检查有一定难度。《中国药典》针对不同性质的药物,收载了三种 测定方法,在建立药物中重金属限量检查方法时,首先应确定采用哪一种测定方法更适宜。 测定方法确定 按照《中国药典》(2010年版)重金属测定第一法操作。根据标准铅溶液最适宜的取用 量为1.0~2.0ml,精密吸取标准铅溶液(10 ug Pb/ml)2m,依法制备,作为标准液(甲管), 另称取样品l0g两份,一份作为样品,依法制备,作为供试液(乙管);另一份加溶剂溶解 后,再加同样量标准铅溶液(2m),同法制备,作为监控溶液(丙管)。取甲、乙、丙三管, 依法操作。比较丙管与甲管所显颜色深浅,当丙管颜色不浅于甲管时,说明药物分子对重金 属检查没有干扰,可用硫代乙酰胺直接显色法(第一法)进行检查。再比较乙管与甲管,分 析所取样品量与标准铅溶液取用量是否合适?若丙管所显颜色浅于甲管,表明药物分子对重 金属测定有干扰,应按炽灼后的硫代乙酰胺法(第二法)进行检查。 限量确定
浙江大学网络教育精品资源共享课 药物的杂质检查案例分析 药物的杂质检查是评价药物纯度的主要方面，特别是有关物质的检查，具有很强的针对 性，其与药物的生产工艺、结构特性密切相关。通过一般杂质和特殊杂质检查的案例分析， 熟悉如何根据合成工艺，药物的稳定性，选择适宜的检查方法、确立最佳测试条件和合理的 限量指标。 案例一 药物中重金属检查方法和限度的确定 概述: 重金属属于一般杂质，广泛存在于自然界中，其为有毒杂质，在体内易积蓄中毒，因此， 多数药物均要控制重金属限量。《中国药典》收载的品种中重金属限量多数控制在百万分之 五至百万分之二十之间。限量制定是否合理，关系到能否真正控制样品中重金属量，可通过 实验半定量方式进行确定。同时重金属可与某些环状结构的药物分子形成较牢固的价健，不 易被检出，需采用炽灼破坏，使有机结合的重金属游离后，再依法检查。而一些药物难溶于 水、稀酸，使直接重金属检查有一定难度。《中国药典》针对不同性质的药物，收载了三种 测定方法，在建立药物中重金属限量检查方法时，首先应确定采用哪一种测定方法更适宜。 测定方法确定: 按照《中国药典》（2010 年版）重金属测定第一法操作。根据标准铅溶液最适宜的取用 量为 1.0～2.0ml，精密吸取标准铅溶液（10μg Pb2＋ 限量确定: /ml）2ml，依法制备，作为标准液（甲管）， 另称取样品 1.0g两份，一份作为样品，依法制备，作为供试液（乙管）；另一份加溶剂溶解 后，再加同样量标准铅溶液（2ml），同法制备，作为监控溶液（丙管）。取甲、乙、丙三管， 依法操作。比较丙管与甲管所显颜色深浅，当丙管颜色不浅于甲管时，说明药物分子对重金 属检查没有干扰，可用硫代乙酰胺直接显色法（第一法）进行检查。再比较乙管与甲管，分 析所取样品量与标准铅溶液取用量是否合适？若丙管所显颜色浅于甲管，表明药物分子对重 金属测定有干扰，应按炽灼后的硫代乙酰胺法（第二法）进行检查
江大学网络教育精品资源共享课 无论采用哪一种方法,在确定限量时应采用半定量方法,即取不同量标准铅溶液,如1.0, 5,2om同时取高、低浓度样品溶液,同法操作,比较系列标准液所显颜色梯度是否明显, 高、低浓度样品液所显颜色落在系列标准颜色何处,由此可判断出样品中重金属的含量,并 据此作出初步限度规定。 样品检验 根据以上实验结果确定样品和标准液取用量,并对不同批号样品进行检查,每批样品做 双份,检验上述确定的限量是否适宜,同时对样品中重金属检查是否符合规定作岀判断。并 按照中国药典格式撰写药物的重金属检查方法 该案例说明的主要问题 般杂质检查方法的选择,采用半定量方法确定杂质的限量,杂质标准液取用量和样品 取样量的确定 案例二 根据阿司匹林的合成工艺和结构性质,设计特殊杂质检查项目和测定方法 合成工艺路线 COOH ONa ONa (CH3CO)20 + Ch3COOH 乙酰化 可能的特殊杂质: 根据合成路线,可能存在的特殊杂质有水杨酸、苯酚以及反应副产物等,同时由于阿司 匹林具有酯结构,在药物的贮藏或制剂过程中易引起水解,产生水杨酸。因此原料药和制剂 中游离水杨酸是必须控制的特殊杂质,可利用水杨酸有游离酚羟基,阿司匹林无游离酚羟基, 采用三氯化铁(硫酸铁铵)比色法进行控制;也可采用HPLC法检测。 6限量检查方法 ()比色法游离水杨酸的检查 取本品θ.10g,加乙醇lml溶解后,加冷水适量使成5σm,立即加新制的稀硫酸铁铵溶
浙江大学网络教育精品资源共享课 无论采用哪一种方法，在确定限量时应采用半定量方法，即取不同量标准铅溶液，如 1.0， 1.5，2.0ml,同时取高、低浓度样品溶液，同法操作，比较系列标准液所显颜色梯度是否明显， 高、低浓度样品液所显颜色落在系列标准颜色何处，由此可判断出样品中重金属的含量，并 据此作出初步限度规定。 样品检验: 根据以上实验结果确定样品和标准液取用量，并对不同批号样品进行检查，每批样品做 双份，检验上述确定的限量是否适宜，同时对样品中重金属检查是否符合规定作出判断。并 按照中国药典格式撰写药物的重金属检查方法。 该案例说明的主要问题: 一般杂质检查方法的选择，采用半定量方法确定杂质的限量，杂质标准液取用量和样品 取样量的确定。 案例二 根据阿司匹林的合成工艺和结构性质，设计特殊杂质检查项目和测定方法。 合成工艺路线: ONa CO2 COONa ONa H+ COOH OH (CH3CO)2O 乙酰化 COOH OCOCH3 + CH3COOH 可能的特殊杂质： 根据合成路线，可能存在的特殊杂质有水杨酸、苯酚以及反应副产物等，同时由于阿司 匹林具有酯结构，在药物的贮藏或制剂过程中易引起水解，产生水杨酸。因此原料药和制剂 中游离水杨酸是必须控制的特殊杂质，可利用水杨酸有游离酚羟基，阿司匹林无游离酚羟基， 采用三氯化铁（硫酸铁铵）比色法进行控制；也可采用 HPLC 法检测。 限量检查方法： （1）比色法——游离水杨酸的检查 取本品 0.10g，加乙醇 1ml 溶解后，加冷水适量使成 50ml，立即加新制的稀硫酸铁铵溶
江大学网络教育精品资源共享课 液lml,摇匀;30秒钟內如显色,与水杨酸对照液(0.lmg/m)lml同法制得结果比较,不 得更深(0.1% 药物中游离水杨酸含量未知时,应取水杨酸系列对照液做标准曲线进行半定量,以求得 样品中游离水杨酸的含量范围,然后根据实际样品质量,参考药典限度要求,确定本产品中 游离水杨酸的限量 比色法为2005年版《中国药典》方法,其只能检查游离水杨酸的量,不能控制其他有 关物质的量。而且在样品溶解过程中,易发生水解反应,可能导致游离水杨酸含量偏高。2010 年版中国药典改用HPLC法检查 (2)HPLC法游离水杨酸和有关物质的检查 ①色谱条件初步选择:取合成原料、中间体、粗品、成品适量,分别用含1%冰醋酸的 甲醇溶解,配制成0.I~ Img/ml的溶液(注意:阿司匹林易水解,不能用含水流动相作溶剂)。 以ODS柱为分析柱,检测波长可考虑阿司匹林和水杨酸均有较大吸收的波长处,待流动相 条件基本确定后,最根据检测灵敏度要求进行调整。首先考察流动相中有机相种类,可从最 常用的甲醇开始选择,如有必要,改用乙腈、四氢呋喃,或几种有机溶剂合用。同时选择流 动相中有机相比例,对于极性较大的成分,可从50%的有机相开始,根据色谱峰的保留时 间,降低有机相比例或升高有机相比例。一般有机相比例宜从高到低进行选择,这样样品出 峰较快,可以在较短时间內获得较合适的有杋相比例。阿司匹林、水杨酸均具酸性,流动相 中宜添加1%~5%的冰醋酸(注意:若用缓冲盐,应添加到水相中,并测定pH值,常规 ODS柱使用pH为2~8)。取合成粗品,注入高效液相色谱仪,观察各成分峰形状、保留时 间、分离情况,调整流动相成分和比例,使柱效、分离度达到一定要求,保留时间适中。 ②杂质归属与方法专属性考察:取空白溶剂(配制样品溶液的溶剂)、合成原料、中间 体、粗品、成品溶液,在上述基本确定的色谱条件下进行分析,比较色谱图,确定样品溶剂 峰、水杨酸峰、其它有关杂质峰,必要时,可将有关杂质添加到样品液中,以确定杂质的归 属,同时将成品的色谱图与粗品色谱图进行比较,分析最后纯化精制工序的效果,如果杂质 峰较大,就有必要考虑合成工艺或精制方法的改进。在这步分析中应尽可能记录较长的层析 时间,以便确定合理的色谱图记录时间。 同时采用破坏试验,以产生可能的降解产物,考察方法的专属性。取成品,加适宜浓度 的酸、碱或过氧化氢溶液,放置一定时间或加热一定时间(视样品稳定性而异),或采用烘 箱烘烤、日光照射等,然后制成一定浓度溶液,进样分析,破坏程度以样品主峰分解20% 以内为宜。观察产生的杂质峰是否完全分离,并同时取破坏用空白试剂进样分析,以排除干
浙江大学网络教育精品资源共享课 液 1ml，摇匀；30 秒钟内如显色，与水杨酸对照液（0.1mg/ml）1ml 同法制得结果比较，不 得更深（0.1%）。 药物中游离水杨酸含量未知时，应取水杨酸系列对照液做标准曲线进行半定量，以求得 样品中游离水杨酸的含量范围，然后根据实际样品质量，参考药典限度要求，确定本产品中 游离水杨酸的限量。 比色法为 2005 年版《中国药典》方法，其只能检查游离水杨酸的量，不能控制其他有 关物质的量。而且在样品溶解过程中，易发生水解反应，可能导致游离水杨酸含量偏高。2010 年版中国药典改用 HPLC 法检查。 （2）HPLC 法——游离水杨酸和有关物质的检查 ①色谱条件初步选择: 取合成原料、中间体、粗品、成品适量，分别用含 1%冰醋酸的 甲醇溶解，配制成 0.1～1mg/ml 的溶液（注意：阿司匹林易水解，不能用含水流动相作溶剂）。 以 ODS 柱为分析柱，检测波长可考虑阿司匹林和水杨酸均有较大吸收的波长处，待流动相 条件基本确定后，最根据检测灵敏度要求进行调整。首先考察流动相中有机相种类，可从最 常用的甲醇开始选择，如有必要，改用乙腈、四氢呋喃，或几种有机溶剂合用。同时选择流 动相中有机相比例，对于极性较大的成分，可从 50%的有机相开始，根据色谱峰的保留时 间，降低有机相比例或升高有机相比例。一般有机相比例宜从高到低进行选择，这样样品出 峰较快，可以在较短时间内获得较合适的有机相比例。阿司匹林、水杨酸均具酸性，流动相 中宜添加 1%～5%的冰醋酸（注意：若用缓冲盐，应添加到水相中，并测定 pH 值，常规 ODS 柱使用 pH 为 2～8）。取合成粗品，注入高效液相色谱仪，观察各成分峰形状、保留时 间、分离情况，调整流动相成分和比例，使柱效、分离度达到一定要求，保留时间适中。 ②杂质归属与方法专属性考察: 取空白溶剂（配制样品溶液的溶剂）、合成原料、中间 体、粗品、成品溶液，在上述基本确定的色谱条件下进行分析，比较色谱图，确定样品溶剂 峰、水杨酸峰、其它有关杂质峰，必要时，可将有关杂质添加到样品液中，以确定杂质的归 属，同时将成品的色谱图与粗品色谱图进行比较，分析最后纯化精制工序的效果，如果杂质 峰较大，就有必要考虑合成工艺或精制方法的改进。在这步分析中应尽可能记录较长的层析 时间，以便确定合理的色谱图记录时间。 同时采用破坏试验，以产生可能的降解产物，考察方法的专属性。取成品，加适宜浓度 的酸、碱或过氧化氢溶液，放置一定时间或加热一定时间（视样品稳定性而异），或采用烘 箱烘烤、日光照射等，然后制成一定浓度溶液，进样分析，破坏程度以样品主峰分解 20% 以内为宜。观察产生的杂质峰是否完全分离，并同时取破坏用空白试剂进样分析，以排除干
江大学网络教育精品资源共享课 扰。根据以上分析情况进一步调整流动相和检测波长,以达到最佳化 ③检测限和样品测定液浓度的确定:对不同浓度样品液进行测定,比较杂质峰个数,确 定合适的样品液浓度范围。并考察阿司匹林和水杨酸的检测灵敏度。分别取阿司匹林和水杨 酸溶液,采取逐步稀释法,以信噪比等于2~3确定检测限。根据检测限和杂质的限量要求 进一步确定样品测定液浓度。 ④限量检查方法的确定:水杨酸可采用外标法,其他有关杂质可采用主成分自身对照法 原料药中水杨酸限量为0.1%,其它有关杂质总量一般可控制在0.5%。 取阿司匹林成品,根据上述确定浓度配制供试品溶液(如1~5mg/ml),取一定量供试品 溶液,稀释200倍,作为自身对照液(如5~25μg/m);另取水杨酸对照品适量,制成浓度相 当于供试液1/1000倍的溶液(如1~5ug/ml),作为水杨酸对照液;也可将自身对照液和水杨 酸对照液配成混合对照溶液。取混合对照溶液注入液相色谱仪,调节仪器检测灵敏度,使对 照液主成分峰高为满量程的10%~20%,两峰分离度达到一定要求,再精密吸取对照液和供 试品溶液分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的一定倍数(根据实际考察 结果确定记录时间,一般至少为主成分峰保留时间的2倍。 供试品溶液色谱图中如有与水杨酸峰保留时间一致的色谱峰,不得大于对照液中水杨酸 峰面积(也可采用外标法计算水杨酸含量);其它各杂质峰面积和不得大于对照液中阿司匹 林峰面积(也可规定单个杂质峰面积不得大于对照液中阿司匹林峰面积的1/2等,以控制单 个杂质量)。 注:以上阿司匹林色谱条件的选择和方法确定仅为举例,主要是介绍方法设计过程,并 非真实测定条件 该案例说明的主要问题: 特殊杂质检查方法的建立,包括:色谱条件(流动相、检测波长)的选择、杂质归属 方法学评价、限量确定等内容
浙江大学网络教育精品资源共享课 扰。根据以上分析情况进一步调整流动相和检测波长，以达到最佳化。 ③检测限和样品测定液浓度的确定：对不同浓度样品液进行测定，比较杂质峰个数，确 定合适的样品液浓度范围。并考察阿司匹林和水杨酸的检测灵敏度。分别取阿司匹林和水杨 酸溶液，采取逐步稀释法，以信噪比等于 2～3 确定检测限。根据检测限和杂质的限量要求， 进一步确定样品测定液浓度。 ④限量检查方法的确定: 水杨酸可采用外标法，其他有关杂质可采用主成分自身对照法。 原料药中水杨酸限量为 0.1%，其它有关杂质总量一般可控制在 0.5%。 取阿司匹林成品，根据上述确定浓度配制供试品溶液（如 1∼5mg/ml），取一定量供试品 溶液，稀释 200 倍，作为自身对照液(如 5∼25μg/ml)；另取水杨酸对照品适量，制成浓度相 当于供试液 1/1000 倍的溶液（如 1∼5μg/ml)，作为水杨酸对照液；也可将自身对照液和水杨 酸对照液配成混合对照溶液。取混合对照溶液注入液相色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使对 照液主成分峰高为满量程的 10%～20%，两峰分离度达到一定要求，再精密吸取对照液和供 试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的一定倍数（根据实际考察 结果确定记录时间，一般至少为主成分峰保留时间的 2 倍）。 供试品溶液色谱图中如有与水杨酸峰保留时间一致的色谱峰，不得大于对照液中水杨酸 峰面积（也可采用外标法计算水杨酸含量）；其它各杂质峰面积和不得大于对照液中阿司匹 林峰面积（也可规定单个杂质峰面积不得大于对照液中阿司匹林峰面积的 1/2 等，以控制单 个杂质量）。 注：以上阿司匹林色谱条件的选择和方法确定仅为举例，主要是介绍方法设计过程，并 非真实测定条件。 该案例说明的主要问题： 特殊杂质检查方法的建立，包括：色谱条件（流动相、检测波长）的选择、杂质归属、 方法学评价、限量确定等内容
