合肥学院文本动物组织中DNA的制备_生物化学实验11.doc_大学文库

实验11动物组织中M的制备《一)原理风贴是所有生物体的基本组成物质。真核生物主要存在于细胞核中。制答嘴A时应将细散核腰打破方能释故出来。细胞中的路和阳分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞酸碎后。这两种核蛋白将混套在一起，因此，要制备W首先要将这两种核蛋白分开。己知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15l/几NC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的1%：而在 11ANC1的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二统基硫酸销(SS)使蛋白质成分变性。让DXA游离出米，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95的乙醇即可从除去蛋自质的溶液中把NA沉淀出来，获得产品。当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶(s心)立即开始降解NA,如果在破碎细胞后不及时深取抑制酶活的指随，最后将会得不到任何。为此，在本实验中如入柠檬酸盐，TA等整合剂以除Nase必需的g2十离子，使se活性降低。并要求整个分离制备的过程均在4℃以下进行，以减少Nas©的降解作用，最后加入SDs使所有的蛋白质（包括D风ase》变性，当然如果希望获得更大分子的WA封，则在细胞酸辞后，及时加入SS使蛋白质（包括5）变性。并加入蛋白酶K,降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止Nase的降解作用。分子根大、很长，在水中呈弘两状，但限链的双螺旋结构不宜小角度的断叠，使之分子具有刚性，即分子是僵直的(s1iT),小角度的折叠和压挤等臂切力，将使风断裂成碎片，为保证获得大分子N队，操作时应遁免急裂振招，成过大的离心力。转移吸取 NA到不可用过细的吸头，不可延吸延放，。更不能用细的吸头反复吹吸。大分子NA的水溶液呈黏料状，可以用破璃棒罐起米。麦体D具要防止se污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存：抽干后的因体队，性质稳定，可长期保存。生物体内各部位的是相同的，但取材时以含量丰富的部位为主，动物的肝脏、弹、骨、血液、精子等。所有材料，必须新鲜及时使用，或放入一0℃冰翰或液氯冷冻保存

实验 11 动物组织中 DNA 的制备（一）原理 DNA 是所有生物体的基本组成物质。真核生物 DNA 主要存在于细胞核中。制备 DNA 时应将细胞核膜打破方能释放出来。细胞中的 DNA 和 RNA 分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。因此，要制备 DNA 首先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在 0.15mol/LNaC1 的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的 1%）；而在 lmol/LNaCl 的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的 2 倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让 DNA 游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入 95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把 DNA 沉淀出来，获得产品。当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解 DNA，如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施，最后将会得不到任何 DNA。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA 等螯合剂以除 DNase 必需的 Mg2＋离子，使 DNase 活性降低，并要求整个分离制备的过程均在 4℃以下进行，以减少 DNase 的降解作用，最后加入 SDS 使所有的蛋白质（包括 DNase）变性。当然如果希望获得更大分子的 DNA 时，则在细胞破碎后，及时加入 SDS 使蛋白质（包括 DNase）变性，并加入蛋白酶 K，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止 DNase 的降解作用。 DNA 分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但 DNA 链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之 DNA 分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使 DNA 断裂成碎片。为保证获得大分子 DNA，操作时应避免急裂振摇，或过大的离心力。转移吸取 DNA 时不可用过细的吸头，不可猛吸猛放，更不能用细的吸头反复吹吸。大分子 DNA 的水溶液呈黏稠状，可以用玻璃棒缠起来。液体 DNA 只要防止 DNase 污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存；抽干后的固体 DNA，性质稳定，可长期保存。生物体内各部位的 DNA 是相同的，但取材时以含量丰富的部位为主，如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料，必须新鲜及时使用，或放入－20℃冰箱或液氮冷冻保存

DNA 的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。（二）试剂及器材（1）0.15mol/LNaCl–0.015mol/LpH7.0 柠檬酸钠溶液：称取 8.77gNaCl，4.41g 柠檬酸三钠（Na3C6H507·2H20），用约 800ml 蒸馏水溶解后，调节 pH 至 7.0，最后定容至 1000ml。（2）0.15mol/LNaCl–0.1mol/LEDTANa2 溶液：称取 8.77gNaCl，37.2gEDTANa2 溶于约 800ml 蒸馏水中，以 NaOH 调 pH 至 8.0，最后定容至 1000ml。（3）5%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取 5gSDS 溶于 45%（V/V）100ml 的乙醇中。（4）氯仿–异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1 配制。（5）pH8.0TE 缓冲液或 0.01mol/LNaOH：120mol/LTris–HCl，lmol/LEDTANa2。或取 NaOH0.4g 加蒸馏水至 1000ml。（6）95％（V/V）乙醇 1000ml。（7）75％（V/V）乙醇 1000ml。（8）组织捣碎机。（9）玻璃匀浆器。（10）冷冻离心机。（11）冰、粗盐。（三）操作（1）本实验以兔肝脏作材料（其他动物肝脏也可以）。实验前应将兔饥饿 24h 以上，以避免糖原的干扰。（2）用烧杯（500m1）放 1/3 体积的冰，加入少量水及约 20g 食盐，制成冰盐水。（3）将经过饥饿的兔颈部放血致死，迅速开腹取出肝脏，称取约 10g 浸入预先在冰盐水中冷却的 0.15mol/LNaCl–0.015mol/L 柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物；再用少量溶液反复洗涤几次，直至组织块无血为止。（4）将洗净的组织剪成碎块。先加入 20m10.15mol/LNaCl–0.015mol/L 柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆 2～3 次，使细胞充分破碎。最后加入 0.15mol/LNaCl–0.015mol–L 柠檬酸钠溶液至 50ml。（5）匀浆液在 4℃6000r／min 离心 15min，弃上清。在沉淀中加入 4 倍体积冷的 0.15mol/LNaCl–0.015mol/L 柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。如此重复操作 2～3 次，尽量洗去可溶的部分（目的是什么?）。最后弃去上清，留沉淀

合肥学院 文本 动物组织中DNA的制备_生物化学实验11

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