实酸7凝胶层斯法脱盐和分高蛋白质 (一》原理 凡盐析所获得的租制蛋白质（盐析得到的IG)中均含有硫腹铵等盐类，这类将影响以 后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”(desalthir螺)，脱盐常川透析法和减 欧过滋法，这两种方法各有利第。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时同较长， 且盐不导除尽：凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大 所以，要根据具体情况选择使川，前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加， 所以逸用凝敢过滤法。 (二》试剂与器材 (1)SephadexG-25. (2)001750lL,瑞7瞬酸盐援冲液。 (3)奈民(ess1er)试剂：于500a1锥彩框内加入确化钾150g,确110g。秉150z 及蒸牌水100al。用力振荡7一l5ai,至碘的棕色开始转变时，混合液湿度升高，将此瓶浸 于冷水内继续䶫药，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化甲求液为止。将上清液倾入000加1 量简内。加摄馏水至2000a1,混匀备用。 (4)20%(Y)顶基水杨酸溶液。 (5)1.5cm×20m层析柱. (6)黑、白比色腿盘， (三)操作 (1)取层析桂1支(1.5cm×20m),垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀 好的SephadexG-25中的水领倒出去，如入2倍体积的0.0175ml/L,p质.7磷酸盐缓冲液， 并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，雅续加入视匀的Sephadext25,使 凝胶自然沉降高度刊17c■左右，关闭出口，特凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175m1几. 面.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的晴酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。 (2)凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液。将盐析所得全部1G样品加到凝 欧桂表面，打开桂下口，控制流速让1G样品溶液慢慢浸入凝取内。凝散柱面上加一层的 0.0175ol/L,l6.7南酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5a1/min左右。用 试管收集洗税液，每管0滴。 (3)在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否己开始流出。为此，由每支收集管中取
实验 7 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质 （一）原理 凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的 IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以 后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝 胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长， 且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。 所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加， 所以选用凝胶过滤法。 （二）试剂与器材 （1）SephadexG-25。 （2）0.0175mol/L，pH6.7 磷酸盐缓冲液。 （3）奈氏（Nessler）试剂：于 500ml 锥形瓶内加入碘化钾 150g，碘 110g，汞 150g 及蒸馏水 100ml。用力振荡 7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸 于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入 2000ml 量筒内，加蒸馏水至 2000ml，混匀备用。 （4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。 （5）1.5cm×20cm 层析柱。 （6）黑、白比色磁盘。 （三）操作 （1）取层析柱 1 支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀 好的 SephadexG-25 中的水倾倒出去，加入 2 倍体积的 0.0175mol/L，pH6.7 磷酸盐缓冲液， 并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的 SephadexG-25，使 凝胶自然沉降高度到 17cm 左右，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入 0.0175mol/L， pH6.7 磷酸盐缓冲液以 3 倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。 （2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部 IgG 样品加到凝 胶柱表面，打开柱下口，控制流速让 IgG 样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的 0.0175mol/L，pH6.7 磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为 0.5ml/min 左右。用 试管收集洗脱液，每管 10 滴。 （3）在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由每支收集管中取
出【滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴作磺基水杨酸。若呈现白色黑状沉淀即证明已 有蛋白质出现。直河检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液。 ()由经检查含有蛋白质的每管中，取1滴溶液。枚置在白色比色盘孔中，加入1滴 奈氏试剂，若望现棕黄色沉淀说明它含有硫酸陵。合并检查后不含硫酸按的各管收集液，即 为“税盐”后的IG. 注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管。以免造成相 互污染假像。 附：极胶过滤法原理及基本操作 1,眼理 凝胶过滤(gelfiltration),又称为凝胶层析(gelchromatography)、分子锋过浅 (olecularsievefiltratice).凝胶漆透层析(elosnoticchroaatography)等.它是20 世纪0年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及国定 相（凝败）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构.网眼里吸满水后凝胶能账呈柔款而富于弹性的 半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗较上有如篇眼，小于箱眼的物质分 子均可通过，大于席限的物质分子则不隆，战称为“分子筛”。疑胶之所以能将不月分子的 物质分开是因为当敲分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼， 井随着莲动相的移动沿凝胶网限孔道移动，从一个颗粒的网限流出，又透入另一颗粒的网限， 如此连线下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢：大于筛限的分子 则完金被简围推阳面不能进入凝胶网限，只能随流动相沿凝胶颗粒的间像流动，其流程短、 阻力小，流速快，比小分子先流出层析柱：小分子最后蓬出。分子大小介于完全推阻不能进 入或完全漆入凝胶游龈之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分 , 用于极胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex) 琼衙糖（商品名为Sepharose)、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-ce1)及具有一定网限的 图腹璃味等和这些凝胶的衔生物： 下面主要介绍随聚糖凝敢，这是由葡萄糖的多聚物与1一氯-2,3-环氧丙烧交连而成。 环氧丙镜引入丙三醇基将绒状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网灵的大小由多聚葡萄糖的 分子和环氧丙烷的比例（交联度》来控制： 萄豪糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中影胀成为柔款而富于弹性的展胶，其吸
出 1 滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入 1 滴 20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已 有蛋白质出现，直到检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液。 （4）由经检查含有蛋白质的每管中，取 1 滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入 1 滴 奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液，即 为“脱盐”后的 IgG。 注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相 互污染假象。 附：凝胶过滤法原理及基本操作 1．原理 凝胶过滤（gelfiltration），又称为凝胶层析（gelchromatography）、分子筛过滤 （molecularsievefiltration）、凝胶渗透层析（gelosmoticchromatography）等。它是 20 世纪 60 年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定 相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的 半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分 子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的 物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼， 并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼， 如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子 则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、 阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进 入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分 开。 用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为 Sephadex）、 琼脂糖（商品名为 Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为 Bio–gel）及具有一定网眼的 细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。 下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与 1–氯–2、3–环氧丙烷交连而成。 环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的 分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。 葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸
水能力与葡聚糖版校的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，能账的程度小： 交暖度小的，孔径大，吸水多，影账的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量 的大小来表示，常以G-10至G-200号码标记.G后而的数字是其吸水量（毫升水/克干胶） 乘以10所得的值。知G-巧即表示吸水量为2.5和12干胶。市售有G-10、G-5、G-50、 G-75,G-100、G-150、G-200等型号。G-75以上的胶因吸水量大，影张后形志柔软易 变，统称为软胶。G-75以下的称为硬较。 葡素糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万，可根据被分离物质的分子大小及目的选 择使用。一般说SephadexG-10一15通常用于分离肽及“脱盐”。SephadexG-75-200用以 分离各类蛋白质。 凝胶层析是一种物理分离法，葡聚糖凝胶基木上不带电荷望多情性。不与被分离物质发 生反应。所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能 吸用少量蛋白质等被分离的物质，为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.8的NC1 等中性盐缓冲液作洗脱液。 2.操作 《1)凝较溶怅（水化）商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰按湿胶均为干燥颗粒。使用前必须 水化溶账。商品琼脂糖极胶星悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶账。 凝胶溶张有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入满德水中于室温下溶胀：另一种是 置于沸水浴中溶张。各种箱案糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表： 型号溶张时间（小时）2025℃分离范围（蛋白质，好） G-10a3至700 G-153至1500 G-25310001500 G-50315003000 G-75243000^7000 修须浸泡足够的时间以使凝散充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶张不但节省时间，还可 以杀灭凝散中污染的细南并排出网眼中气体。 凝胶溶素后，需用燕第水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的饵小颗较随水领倒出去，以免 在装柱后产生阻寒现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在瓷歌液中用。 一支层析桂中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所雷型号的葡聚糖干取，放
水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小； 交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量 的大小来表示，常以 G–10 至 G–200 号码标记。G 后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶） 乘以 10 所得的值。如 G–25 即表示吸水量为 2.5ml/2 干胶。市售有 G–10、G–5、G–50、 G–75、G–100、G–150、G–200 等型号。G–75 以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易 变，统称为软胶。G–75 以下的称为硬胶。 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选 择使用。一般说 SephadexG–l0～15 通常用于分离肽及“脱盐”。SephadexG–75～200 用以 分离各类蛋白质。 凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发 生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能 吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达 0.08 的 NaCl 等中性盐缓冲液作洗脱液。 2．操作 （1）凝胶溶胀（水化）商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须 水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。 凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种是 置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表： 型号溶胀时间（小时）20~25℃分离范围（蛋白质，Mr） G-103 至 700 G-153 至 1500 G-2531000~1500 G-5031500~3000 G-75243000~7000 必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可 以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼中气体。 凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免 在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。 一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取 1g 所需型号的葡聚糖干胶，放
在51量慎中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶张后凝胶的体积。然后在层析柱中加水 列所清柱床高度，将水倒出。量数柱床体积。根据1黑干胶溶账后的体积和所需柱床体积： 即可性算出干胶的香要量。 (2)装柱将层析制装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。 层析柱有玻璃和透明塑料的两种，柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结酸 璃珍版成尼龙布，能阻止层析剂流出。溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱。可以选用目 细均匀，长短合适的破璃管，在两端海上合适的胶事，胶事中插人细玻璃管，在一端放一层 尼龙布为出口。即可作为层析柱使用，层析柱的长短粗细根据实险的目的而定，一般说来， 凝取胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释透成扩散，反而影 响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1以下的柱易发生“管壁效应”，即柱中部分的物 质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，迹成分离混乱。当然柱的内径也不宜过租。 疑败层析中，在把小分子物质(m<100》,知无机成其他物质与大分子物质(<20000) 分离时，层析桂的体积一般的为样品的4-10倍，高度与直径的比例为5：1至15：1之间。 这类柱也称为“脱盐”柱，常用网孔根小的极校如G一25。用以将生物大分子物质棱此分开 的分级层析柱。体积应为样品体积的25~100倍。柱长度与直径的比例为20：1~100,1。 装柱的操作过程如下：将层析柱垂直因定在支架上，打开柱下口开美。将溶张好的凝胶 放在烧杯中，使凝取表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒授匀凝胶液。顺玻璃棒灌入柱 内。此时柱下口一边棒水，上口一边加入授匀的漫胶，可见凝胶违续均匀地沉降，逐步形成 凝取柱。当到达所需凝胶桂高度时，立即关闭下口，待凝取白然沉降形成凝敢柱依。凝胶桂 床一般应离柱顶35c■，并爱盖一层溶液。 灌注覆救时要求将均匀的覆敢一直加到所雷桂宋高度，不能时断时续，否测将出现分层 或“纹路”等毛病。若中途出现这些现象，可以用玻璃棒将己形成的柱床逐步搅起，直至出 毛病的部分再让凝胶重新沉降或维续加入授匀的凝胶悬液。若在灌好胶后才发现“纹路”， 分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均 匀往往从表面上看不出来。所以使用前应该用一些梦色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋 白或专用的蓝色葡聚糖-2000(B10d和xtTn-2000)通过凝胶柱。观察形成的色斑箭是否 整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱。直至达到要求。 刚从冰箱中取出的凝较液，不跪马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶 会产生大量的气泡影响层析。 在整个灌注凝散的过程及使用中。凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气
在 5ml 量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水 到所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据 1g 干胶溶胀后的体积和所需柱床体积， 即可推算出干胶的需要量。 （2）装柱将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。 层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻 璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗 细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层 尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来， 凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散，反而影 响分离效果。柱的内径不宜较细，直径 1cm 以下的柱易发生“管壁效应”，即柱中部分的物 质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。 凝胶层析中，在把小分子物质（mw<1500），如无机或其他物质与大分子物质（mw<20000） 分离时，层析柱的体积一般约为样品的 4–10 倍，高度与直径的比例为 5：1 至 15：1 之间。 这类柱也称为“脱盐”柱，常用网孔很小的凝胶如 G–25。用以将生物大分子物质彼此分开 的分级层析柱，体积应为样品体积的 25～100 倍。柱长度与直径的比例为 20：1～100：1。 装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶 放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱 内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成 凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时，立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱 床一般应离柱顶 3~5cm，并覆盖一层溶液。 灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层 或“纹路”等毛病。若中途出现这些现象，可以用玻璃棒将已形成的柱床逐步搅起，直至出 毛病的部分再让凝胶重新沉降或继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好胶后才发现“纹路”、 分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均 匀往往从表面上看不出来。所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素 C、血红蛋 白或专用的蓝色葡聚糖–2000（Bluedextran–2000）通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否 整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。 刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶 会产生大量的气泡影响层析。 在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气
若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。 (3)平衡装好的凝胶柱。使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶 柱，以压实凝胶，称为平衡 (4)上样将样品加入到凝胶柱中，准各层析的过程称上样。上样时，应该注意上样量 的多少、样品的黏丽度及离了强度。这三个因素会形响到以后层析的效果。一般来说“原盐 层析时，上样体积可为柱体积的10一25：生物大分子的分级分离，约为柱体积的，一5飞 样品的黏积度一般不宜大于洗脱液黏制度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜，离子强度 要达到Q.8,以免产生特异性吸附 上样操作：先打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的溶液，或用皮头吸管吸取，使 液面与凝胶表面相平齐，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口 开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。加样时注意匆将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能 沿管壁流下，以免样品沿柱空与凝胶柱的问凝胶煤漏下。当侯授渗入凝胶的样品液液面与凝 胶柱面相平时，关闭下口，完成上样，然后在凝胶柱面上加一层(3一5m)洗脱液，接上洗 脱瓶准备洗脱」 (5)洗脱用规定的溶液流过样品，使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的 过程称为洗脱。所用溶液称洗脱液。洗股液放在贮液瓶（洗脱雅）中并与层析柱相通连。流 脱时只要打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出 洗脱过程中保持定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件。因为凝胶层析的分 离作用主要取决于分了扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分了来不及在分了筛中分配而 出：过慢时己分离的分子会因扩敢而混合。因而要保持适当的恒定流速。洗脱液的流速取决 于它的箭水压。静水压是指洗脱瓶中洗税液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力（或接 触空气的两个液面问的高差)，这个高度整越大，静水压越大，洗脱液的流速就越快，这个 压力差可以调动，如提高洗脱的位或瓶中浪面的增减：或者降低或提高层析柱出口的位 置等，因此静水压又称操作压。 由于静水压越大，洗影液的流速就越快，在因定洗税瓶与出口位置的情况下，静水压会 在洗脱过程中。随着洗脱瓶中溶液减少液面不断下降面减少，难以维特流速的恒定。为了解 决这个问题，T0tte背次将洗脱瓶加塞塞紧，塞中插入我璃管，使玻管下口深入到洗脱 液的底部，这样洗聪液的静水压便等于此玻管下口的液面高出层析柱出口液面的高度（因为 当洗脱瓶液体流出时，瓶顶形成真空，空气只从玻璃管中进入，玻管下口即为接触空气点)， 因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增诚将不彭响静水压，从而自动保持
若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。 （3）平衡装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶 柱，以压实凝胶，称为平衡。 （4）上样将样品加入到凝胶柱中，准备层析的过程称上样。上样时，应该注意上样量 的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说“脱盐” 层析时，上样体积可为柱体积的 10%～25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的 1%～5%。 样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的 2 倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度 要达到 0.08，以免产生特异性吸附。 上样操作：先打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的溶液，或用皮头吸管吸取，使 液面与凝胶表面相平齐，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口 开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能 沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶柱的间凝胶隙漏下。当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝 胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（3～5cm）洗脱液，接上洗 脱瓶准备洗脱。 （5）洗脱用规定的溶液流过样品，使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的 过程称为洗脱。所用溶液称洗脱液。洗脱液放在贮液瓶（洗脱瓶）中并与层析柱相通连。洗 脱时只要打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出。 洗脱过程中保持恒定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件。因为凝胶层析的分 离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流 出；过慢时已分离的分子会因扩散而混合。因而要保持适当的恒定流速。洗脱液的流速取决 于它的静水压。静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力（或接 触空气的两个液面间的高差），这个高度差越大，静水压越大，洗脱液的流速就越快。这个 压力差可以调动，如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减；或者降低或提高层析柱出口的位 置等，因此静水压又称操作压。 由于静水压越大，洗脱液的流速就越快。在固定洗脱瓶与出口位置的情况下，静水压会 在洗脱过程中，随着洗脱瓶中溶液减少液面不断下降而减少，难以维持流速的恒定。为了解 决这个问题，Marriotte 首次将洗脱瓶加塞塞紧，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脱 液的底部，这样洗脱液的静水压便等于此玻管下口的液面高出层析柱出口液面的高度（因为 当洗脱瓶液体流出时，瓶顶形成真空，空气只从玻璃管中进入，玻管下口即为接触空气点）， 因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增减将不影响静水压，从而自动保持
了流速的恒定，此洗脱粒称为恒瓜瓶，也叫马氏瓶。当然，当洗脱液减少至液面低于玻管的 下口时，便会失去作用，但这时可用及时加入洗脱波来解决。 在凝胶层析中，不仅要保持静水压的恒定，还要保持适当的静水压。这是因为G-75 以上的软胶敢体柔软易变形，对静水压仅有一定的承受能力，不同软败的承受能力也不相同 静水压超过凝胶的承受能力时，最初流速会很快：共后随着静水瓜力过大将使软敢变形压紧。 流速逐渐降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结牙 的必要条件， 脱盐般使用的是G-25属于硬胶，硬胶不易变形，受静水压的影响较小，实验过程中 的流速可用恒压瓶下口橡皮管上的螺夹控制在Q.5m1/mm左右，随着洗脱液的流出，样品 遂步被分开。用试管收集洗影液，按顺序每管收集21。 (6)检测在收集的同时，检查蛋白质是否流出。于每管中取出1滴放在黑色比色板孔 中（技编号顺序），再分别加入1滴20%磺酰水扬酸，如出现白色沉淀即表示或白质己流出 凝胶柱，知此一直检查到蛋白质全流出为止。与此同时，再从蛋白质的管中取出1滴于白色 比板中，加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去。合 并纯化后的蛋白质管以用。以光密度位为纵坐标，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸 上绘图。可获具有·条沈税静的曲线，称为洗脱曲线。用以表示被分离物质流出的状态。 (?)凝胶的洗涤及保存由于凝胶对被分离的物质基本无吸作用，所以无需“再生 只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐萍沉积压餐，流速将减慢 所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。 凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室温保存应加入Q.02%叠 氨钠(a3)或Q.01%乙酸汞等防腐剂，以防发莓.用时以水洗去防腐剂即可使用.凝胶长 不用，可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡， 再换·下浓度的乙醇，让凝胶遂步脱水，再用乙醚除乙醉，抽干即可，或将凝胶洗净后抽干 在表面皿上30℃遂步拱干
了流速的恒定，此洗脱瓶称为恒压瓶，也叫马氏瓶。当然，当洗脱液减少至液面低于玻管的 下口时，便会失去作用，但这时可用及时加入洗脱液来解决。 在凝胶层析中，不仅要保持静水压的恒定，还要保持适当的静水压。这是因为 G–75 以上的软胶胶体柔软易变形，对静水压仅有一定的承受能力，不同软胶的承受能力也不相同， 静水压超过凝胶的承受能力时，最初流速会很快；其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧， 流速逐渐降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果 的必要条件。 脱盐一般使用的是 G–25 属于硬胶，硬胶不易变形，受静水压的影响较小，实验过程中 的流速可用恒压瓶下口橡皮管上的螺旋夹控制在 0.5ml/min 左右，随着洗脱液的流出，样品 逐步被分开。用试管收集洗脱液，按顺序每管收集 2ml。 （6）检测在收集的同时，检查蛋白质是否流出。于每管中取出 1 滴放在黑色比色板孔 中（按编号顺序），再分别加入 1 滴 20%磺酰水扬酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出 凝胶柱，如此一直检查到蛋白质全流出为止。与此同时，再从蛋白质的管中取出 1 滴于白色 比板中，加入奈氏试剂 1 滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去。合 并纯化后的蛋白质管以待用。以光密度值为纵坐标，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸 上绘图。可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线，用以表示被分离物质流出的状态。 （7）凝胶的洗涤及保存由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需“再生”， 只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢， 所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。 凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中，存放在 4℃冰箱中。若放在室温保存应加入 0.02%叠 氮钠（NaN3）或 0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。凝胶长 期不用，可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡， 再换一下浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或将凝胶洗净后抽干， 在表面皿上 30℃逐步烘干