实脸5丽防酸的卵氧化—酮体测定法 《一)原理 酮体包括乙酰乙酸、B一羟丁酸和丙酮三种物质。在肝脏中，脂防酸经B一氧化作用生 成乙酰CA。生成的乙酰CA可经代谢缩合成乙酰乙酸，而乙酰乙酸既可度羧生成丙酮，又 可经B一羟丁酸税氢酶作用被还原生成B一羟丁酸，三种物质统称酮体。丽体为机体代谢的 正常中间产物。在肝脏中生成后類被运往肝外组织才能被机体所利用。在正常情况下，动物 体内含量甚微：悲糖尿或食用高脂防稀食时，血中酮体含量增高。尿中也能出现酮体。 本实验用丁酸做底物，将之与新鲜的肝匀浆一起保温后，再测定其中酮体的生成量。 因为在碱性溶液中确可以将内刚氧化为确仿(QI3),所以通过用硫代硫酸钠(2S23) 滴定反应中剩余的碘就可以计算出所清耗的碘量，进而可以求出以丙酮为代表的酮体含量， 有关的反应式如下： C300C8+4Na0H+3I2CH13+C000Wa+3Tl20 12+2Na2503Na2S06+2X1 恨据滴定样品与滴定对孤所消耗的硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮 的量。 (二)试剂及器材 (1)10%(/v)氢氧化钠溶液：称取10咖氢氧化钠，在烧杯中用少量蒸馏水将之溶解 后，定容至100l. (2)Q.10lL,正丁酸溶液：称取13g碘和的0w确化钾，放置于研体中，加入少量蒸 偏水后，将之研磨至溶解。用蒸馆水定容到10001，在棕色瓶中保存，此时可用标准硫代 硫酸的溶液标定其浓度。 (3)Q5aol/L正ET酸：取0.05al正T酸，用Q.5olL氢氧化钠溶液100al溶解即成. (4)Q,10L/L确酸钾(K103)溶液：称取Q,8918g干燥的碘酸钾，用少量蒸管水将之 溶解，最后定容至250m (5)0.1o1/L硫代硫酸钠(Na2520四)溶液：称取25z隐代硫酸钠，将它溶解于适量 煮沸的燕管水中，并莲候煮沸5ai。冷却后，用冷却的已煮沸过的蒸第水定容到IO00ml。 此时即可用Q,1小/L碘酸钾溶液标定其浓度。 (6)硫代陵酸销溶液的标定：将燕管水25和1，碘化钾2g、碳酸氯销Q5g、10%盐酸溶 液20l如入一支维形瓶内。另取0.101/L确酸钾溶液25l如入其中，然后用硫代硫酸钠
实验 5 脂肪酸的-氧化—酮体测定法 （一）原理 酮体包括乙酰乙酸、—羟丁酸和丙酮三种物质。在肝脏中，脂肪酸经—氧化作用生 成乙酰 CoA。生成的乙酰 CoA 可经代谢缩合成乙酰乙酸，而乙酰乙酸既可脱羧生成丙酮，又 可经—羟丁酸脱氢酶作用被还原生成—羟丁酸，三种物质统称酮体。酮体为机体代谢的 正常中间产物，在肝脏中生成后须被运往肝外组织才能被机体所利用。在正常情况下，动物 体内含量甚微；患糖尿或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。 本实验用丁酸做底物，将之与新鲜的肝匀浆一起保温后，再测定其中酮体的生成量。 因为在碱性溶液中碘可以将丙酮氧化为碘仿（CHI3），所以通过用硫代硫酸钠（Na2S2O3） 滴定反应中剩余的碘就可以计算出所消耗的碘量，进而可以求出以丙酮为代表的酮体含量。 有关的反应式如下： CH3COCH3+4NaOH+3I2CHI3+CH3COONa+3NaI+3H2O I2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaI 根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮 的量。 （二）试剂及器材 （1）10%（w/v）氢氧化钠溶液：称取 10g 氢氧化钠，在烧杯中用少量蒸馏水将之溶解 后，定容至 100ml。 （2）0.1mol/L 正丁酸溶液：称取 13g 碘和约 40g 碘化钾，放置于研钵中。加入少量蒸 馏水后，将之研磨至溶解。用蒸馏水定容到 1000ml，在棕色瓶中保存。此时可用标准硫代 硫酸钠溶液标定其浓度。 （3）0.5mol/L 正丁酸：取 0.05ml 正丁酸，用 0.5mol/L 氢氧化钠溶液 100ml 溶解即成。 （4）0.1mol/L 碘酸钾（KIO3）溶液：称取 0.8918g 干燥的碘酸钾，用少量蒸馏水将之 溶解，最后定容至 250ml （5）0.1mol/L 硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液：称取 25g 硫代硫酸钠，将它溶解于适量 煮沸的蒸馏水中，并继续煮沸 5min。冷却后，用冷却的已煮沸过的蒸馏水定容到 1000ml。 此时即可用 0.1mol/L 碘酸钾溶液标定其浓度。 （6）硫代硫酸钠溶液的标定：将蒸馏水 25ml、碘化钾 2g、碳酸氢钠 0.5g、10%盐酸溶 液 20ml 加入一支锥形瓶内。另取 0.1mol/L 碘酸钾溶液 25ml 加入其中，然后用硫代硫酸钠
溶液将之滴定至浅黄色。再加入0,1淀粉溶液2，然后雅续用硫代硫酸销溶液将之满定至 蓝色消褪为止。 另设一空白，其中仪以蒸馏水代替确酸钾，其余操作相同。计算硫代硫酸销溶液的浓度 所依据的反应式如下！ 5K1+KI0346HCI-312+6KCI+3H20 12+2%a2203=a25406+2Xa1 (T)10%(/y)盐酸常液：取10al盐酸，用燕第水稀释到100加1. (8)0.1(需/)淀粉溶液：称取0.1g可溶性淀粉。置于研体中。加入少量横冷的蒸馏 水，将淀粉调成糊状。再慢慢倒入煮沸的蒸增水90■1,2匀后。再用蒸情水定容至100加。 (9)0.9%(/v)氧化钠. (10)1/15ml/L.、P.7菊酸缓冲液 (A液)1/15ol/LNm2H04溶液，称取Na2HP04·2H201,187g,将之溶解于100ml蒸帽 水中即成。 (B液)1/15aol/LUK201溶液：称取2PD0.9078z,将之溶解千100a1蒸德水将之 溶解，最后定容至100ml。 取A液901、B液1阳液，将两者漫合即可。 (12)匀浆器（成授拌机）、碘量瓶。 《三)操作 1,肝匀浆的制备注1】 (1)将动物（如鸡、家兔、大鼠或豚鼠等》敏血处死，取出肝鞋。 (2)用0.9明氯化钠溶液洗去肝鞋上的污血，然后用滤纸吸去表面的水分。溶液至总体 积为10ml. 2.阴体生成 (1)数两个锥形瓶，编号，按下表操作。 桩形瓶 试剂(l) 新鲜肝匀浆 2.0 面生煮洗的肝匀案 20 肌乙的蓝酸缓冲凌 3.0 30 05ml正广酸溶液？0 20 (2)将加好试剂的2个性形框摇匀，皮入43C恒温水溶锅中保温0后取出
溶液将之滴定至浅黄色。再加入 0.1%淀粉溶液 2ml，然后继续用硫代硫酸钠溶液将之滴定至 蓝色消褪为止。 另设一空白，其中仅以蒸馏水代替碘酸钾，其余操作相同。计算硫代硫酸钠溶液的浓度 所依据的反应式如下： 5KI+KIO3+6HCI=3I2+6KCI+3H2O I2+2Na2S2O3=Na2S4O6+2NaI (7)10%(v/v)盐酸溶液：取 10ml 盐酸，用蒸馏水稀释到 100ml。 （8）0.1%(w/v)淀粉溶液：称取 0.1g 可溶性淀粉，置于研钵中。加入少量预冷的蒸馏 水，将淀粉调成糊状。再慢慢倒入煮沸的蒸馏水 90ml，搅匀后，再用蒸馏水定容至 100ml。 （9）0.9%(w/v)氯化钠。 （10）1/15mol/L、PH7.7 磷酸缓冲液 （A 液）1/15mol/LNa2HPO4 溶液：称取 Na2HPO4·2H2O1.187g，将之溶解于 100ml 蒸馏 水中即成。 （B 液）1/15mol/LKH2PO4 溶液：称取 KH2PO40.9078g，将之溶解于 100ml 蒸馏水将之 溶解，最后定容至 100ml。 取 A 液 90ml、B 液 10B 液，将两者混合即可。 （12）匀浆器（或搅拌机）、碘量瓶。 （三）操作 1．肝匀浆的制备[注 1] （1）将动物（如鸡、家兔、大鼠或豚鼠等）放血处死，取出肝脏。 （2）用 0.9%氯化钠溶液洗去肝脏上的污血，然后用滤纸吸去表面的水分。溶液至总体 积为 10ml。 2．酮体生成 （1）取两个锥形瓶，编号，按下表操作。 锥形瓶 试剂（ml） A B 新鲜肝匀浆 — 2.0 预先煮沸的肝匀浆 2.0 — PH7.7 的磷酸缓冲液 3.0 3.0 0.5mol/L 正丁酸溶液 2.0 2.0 （2）将加好试剂的 2 个锥形瓶摇匀，放入 43℃恒温水浴锅中保温 40min 后取出
(3)于2个锥形瓶分别加入20%三氯乙酸溶液[注2]3a1,摇匀后，于室温放置101 《4)将辈形瓶中的混合物分别用花纸在漏斗上过滤，收集无蛋白滤液于事先偏号A、 的试管中。 3.制体的测定 (1)取碘量瓶[注3]2个，根据上述编号顺序按下表操作。 确量瓶编号 A B 试剂(l) 无蛋白浅液 50 50 DmlL确液 30 30 106Xa00 30 30 (2)加完试剂后超匀，将确量瓶于蜜温故置10阳鱼： (3)于各确量氧分别滴如1网盐酸溶液，使各瓶中溶液中和到中性或微酸性《可用阳 试纸选行检测)： 《4)用0.021/L硫代硫酸钠溶液滴定到确量瓶中的溶液呈浅黄色时，往瓶中滴加数 滴0.1%淀粉溶液，使惠中溶液呈监色。 (5)继续用0.02ml/九.硫代硫酸钠溶液满定到碘量瓶中溶液的蓝色消键为止， (6)记录下滴定时所用去的硫代编酸销溶液毫升数，按下式计算样品中丙酮的生成量。 4,结果与计算 根据滴定样品与对照所清耗的硫代硫的溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的 量。 实验中所用肝匀案中生成内刚的量(1)=(A一B)×C×1/6 A:为滴定样品A(对思)所消耗的0,0心？/L硫代硫酸销溶液的毫升数。 B:不滴定样品B所消耗的0.2o1/L硫代硫酸钠溶液的毫升数。 C:硫代硫酸钠溶液的浓度（©1L.) 注 [1]肝匀浆必须新解，放置久则失去氧化脂防酸能力： [2]三氯乙酸作用是使肝匀装的蛋白质、酶变性，发生沉淀。 [3】碘量瓶作用是防止碘液挥发，不修用锥形瓶代替
（3）于 2 个锥形瓶分别加入 20%三氯乙酸溶液[注 2]3ml，摇匀后，于室温放置 10min。 （4）将锥形瓶中的混合物分别用滤纸在漏斗上过滤，收集无蛋白滤液于事先编号 A、B 的试管中。 3．酮体的测定 （1）取碘量瓶[注 3]2 个，根据上述编号顺序按下表操作。 碘量瓶编号 试剂（ml） A B 无蛋白滤液 5.0 5.0 0.1mol/L 碘液 3.0 3.0 10%NaOH 3.0 3.0 （2）加完试剂后摇匀，将碘量瓶于室温放置 10min。 （3）于各碘量瓶分别滴加 10%盐酸溶液，使各瓶中溶液中和到中性或微酸性（可用 PH 试纸进行检测）。 （4）用 0.02mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定到碘量瓶中的溶液呈浅黄色时，往瓶中滴加数 滴 0.1%淀粉溶液，使瓶中溶液呈蓝色。 （5）继续用 0.02mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定到碘量瓶中溶液的蓝色消褪为止。 （6）记录下滴定时所用去的硫代硫酸钠溶液毫升数，按下式计算样品中丙酮的生成量。 4．结果与计算 根据滴定样品与对照所消耗的硫代硫钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的 量。 实验中所用肝匀浆中生成丙酮的量（mol）=（A－B）×C×1/6 A：为滴定样品 A（对照）所消耗的 0.02mol/L 硫代硫酸钠溶液的毫升数。 B：不滴定样品 B 所消耗的 0.02mol/L 硫代硫酸钠溶液的毫升数。 C：硫代硫酸钠溶液的浓度（mol/L） 注： [1]肝匀浆必须新鲜，放置久则失去氧化脂肪酸能力。 [2]三氯乙酸作用是使肝匀浆的蛋白质、酶变性，发生沉淀。 [3]碘量瓶作用是防止碘液挥发，不能用锥形瓶代替