第一部分 肉与肉制品化学指标测定实验 实验七 肉与肉制品中聚磷酸盐含量的测定 一、薄层分析法 （一）测定原理 用三氯乙酸提取肉和肉制品的聚磷酸盐、提取液经乙醇、乙醚处理后，用微晶纤维素薄 层层析板分离，通过喷雾显色检验聚磷酸盐。 （二）仪器和材料 实验室常规仪器。绞肉机，孔径不超过 4mm。实验室用匀浆器。涂 0.25mm 厚板的涂 布器。玻璃板：10×20cm**2，5×20cm**2。层析缸。微量注射器。吹风机：有冷、热风挡。 喷雾器。 （三）试剂 所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或相当纯度的水。 三氯乙酸。乙醚。95％乙醇。薄层板：用薄层用的微晶纤维素制备，或同样的预制板。 可溶性淀粉。 标准参比混合液 在 100mL 水中溶解下列物质：磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）200mg，焦 磷酸四钠（Na4P2O7·10H2O）300mg，三磷酸五钠（Na5P3O10）200mg，六偏磷酸钠(NaPO3) x（x ＞10）200mg。 展开剂 将异丙醇 140mL，浓度为 135g/L 的三氯乙酸，水溶液 40mL，氢氧化铵， 0.6mL 混合均匀，放入密闭瓶中。 显色剂Ⅰ 将同体积的浓硝酸与浓度为 75g/L 的四水钼酸铵溶液混合，在 100mL 上 述溶液中溶解酒石酸 10g（现用现配）。 显色剂Ⅱ 在浓度为 150g/ L 焦亚硫酸钠溶液 195mL 与浓度为 200g/L 的亚硫酸钠溶 液 5mL 的混合液中溶解 1-氨基-2-萘-4-磺酸 0.5g，再在此溶液中溶解结晶乙酸钠 40g。溶液 贮于密闭的棕色瓶中，于冰箱保存，可存放一周。 （四）操作方法与步骤 1．取样 至少取有代表性的试样 200g，于绞肉机中至少绞两次使其均质化并混匀，贮于密闭容 器中备用。 尽快分析试样，不得超过 5h。 2．薄层板的制备 将可溶性淀粉 0.3g 溶解在 90mL 沸水中，冷却后加入微晶纤维素粉 15g，用匀浆器均化 1min。用涂布器把浆液涂在玻璃板上，铺成 0.25mm 厚的浆层，在室温下自然干燥 1h，再 在 100℃烘箱中加热 10min，取出立即放入干燥器中。也可以用予制的微晶纤维素板。 3．提取聚磷酸盐 将 40～60℃的水 15mL 倒入装有 50g 试样的烧杯中，搅拌，不超过 5min。加入三氯乙 酸 10g，彻底搅匀。迅速放入冰箱冷却 1h 后，取出，用扇形滤纸过滤。若滤液混浊，加固 体积的乙醚摇动一次，用吸管吸出醚弃去，水相中加入同体积的乙醇振摇 1min，静置几分 钟，用扇形滤纸过滤。 4．薄层层析分离 将适量展开剂倒入层析缸中，使深度为 5～10mm，盖上盖，避光静置 30min。用微量 注射器取提取液 3μL，若是经过澄清处理的取 6μL，点在距板底边约 2cm 处的师薄层板上， 尽量使点的直径很小。用吹风机的冷风档吹干
第一部分 肉与肉制品化学指标测定实验 实验七 肉与肉制品中聚磷酸盐含量的测定 一、薄层分析法 （一）测定原理 用三氯乙酸提取肉和肉制品的聚磷酸盐、提取液经乙醇、乙醚处理后，用微晶纤维素薄 层层析板分离，通过喷雾显色检验聚磷酸盐。 （二）仪器和材料 实验室常规仪器。绞肉机，孔径不超过 4mm。实验室用匀浆器。涂 0.25mm 厚板的涂 布器。玻璃板：10×20cm**2，5×20cm**2。层析缸。微量注射器。吹风机：有冷、热风挡。 喷雾器。 （三）试剂 所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或相当纯度的水。 三氯乙酸。乙醚。95％乙醇。薄层板：用薄层用的微晶纤维素制备，或同样的预制板。 可溶性淀粉。 标准参比混合液 在 100mL 水中溶解下列物质：磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）200mg，焦 磷酸四钠（Na4P2O7·10H2O）300mg，三磷酸五钠（Na5P3O10）200mg，六偏磷酸钠(NaPO3) x（x ＞10）200mg。 展开剂 将异丙醇 140mL，浓度为 135g/L 的三氯乙酸，水溶液 40mL，氢氧化铵， 0.6mL 混合均匀，放入密闭瓶中。 显色剂Ⅰ 将同体积的浓硝酸与浓度为 75g/L 的四水钼酸铵溶液混合，在 100mL 上 述溶液中溶解酒石酸 10g（现用现配）。 显色剂Ⅱ 在浓度为 150g/ L 焦亚硫酸钠溶液 195mL 与浓度为 200g/L 的亚硫酸钠溶 液 5mL 的混合液中溶解 1-氨基-2-萘-4-磺酸 0.5g，再在此溶液中溶解结晶乙酸钠 40g。溶液 贮于密闭的棕色瓶中，于冰箱保存，可存放一周。 （四）操作方法与步骤 1．取样 至少取有代表性的试样 200g，于绞肉机中至少绞两次使其均质化并混匀，贮于密闭容 器中备用。 尽快分析试样，不得超过 5h。 2．薄层板的制备 将可溶性淀粉 0.3g 溶解在 90mL 沸水中，冷却后加入微晶纤维素粉 15g，用匀浆器均化 1min。用涂布器把浆液涂在玻璃板上，铺成 0.25mm 厚的浆层，在室温下自然干燥 1h，再 在 100℃烘箱中加热 10min，取出立即放入干燥器中。也可以用予制的微晶纤维素板。 3．提取聚磷酸盐 将 40～60℃的水 15mL 倒入装有 50g 试样的烧杯中，搅拌，不超过 5min。加入三氯乙 酸 10g，彻底搅匀。迅速放入冰箱冷却 1h 后，取出，用扇形滤纸过滤。若滤液混浊，加固 体积的乙醚摇动一次，用吸管吸出醚弃去，水相中加入同体积的乙醇振摇 1min，静置几分 钟，用扇形滤纸过滤。 4．薄层层析分离 将适量展开剂倒入层析缸中，使深度为 5～10mm，盖上盖，避光静置 30min。用微量 注射器取提取液 3μL，若是经过澄清处理的取 6μL，点在距板底边约 2cm 处的师薄层板上， 尽量使点的直径很小。用吹风机的冷风档吹干
注： 避免热风，防止磷酸盐水解。 用同法将标准参比液 3μL 点在同一块板上，距样品点 1～1.5cm，距板底距离与样品点 一致打开层析缸盖，迅速而小心地把点过样的薄层板放入缸中，盖上盖，避光在室温下展开。 展开到溶剂前沿上升约 10cm 处，取出薄层板，放进烘箱中干燥 10min（可在室温下干燥 30min 或用吹风机冷风档吹干）。 5．碳酸盐的检验 展开过的薄层板立在通风橱中，用喷雾器把显色剂Ⅰ均匀地喷到板上，出现黄斑。用吹 风机吹干簿层板，放进 100℃烘箱至少烘 1h，把硝酸全部除去。薄层板冷却至室温，再放入 通风橱中，喷显色剂Ⅱ，出现明显的蓝斑。 注： 不是绝对要喷显色剂Ⅱ，但此显色剂产生强烈的蓝斑可提高检测效果。 同一试样进行两次检验。 （五）结果的表示 将试样的斑点与磷酸盐标准参比混合液斑点移动距离相比较。 标准参比混合液磷酸盐的 Rf 值见下表 名 称 正磷酸盐 焦磷酸盐 三聚磷酸盐 六偏磷酸盐 Rf 0.70～0.80 0.35～0.50 0.20～0.30 0 一般在肉和肉制品中提取磷酸盐的 Rf 值偏低。 注：可用鲜肉的提取液校正磷酸盐的 Rf 值，鲜肉中只含正磷酸盐。 二、化学分析法 （一）原理： 测定磷酸盐时，先将不完全干燥的样品灰化，然后使磷酸盐水解为正盐，再以磷相酸喹 啉形成离析出来。 首先，将磷酸盐生成磷铝酸（有柠檬酸盐存在时），然后磷铝酸再与碱、喹啉形成磷铝 酸喹啉，柠檬酸能与铵离子结合，阻止磷锃酸铵沉淀的出现。 最初，测定时需要制备两种溶液，以生成磷铝酸喹啉沉淀，即柠檬酸——铝酸溶液和喹 啉溶液，后来使用了丙酮，使这种溶液合二为一，即可用一种试剂作为沉淀剂，我们把该种 沉淀剂称为喹铝柠酮试剂，它是由混合物中的铝酸盐，柠檬酸盐和丙酮的英文名字的字头命 名的。 （二）仪器 ① 古氏坩锅（coors4 号）（布氏漏斗）； ② 玻璃纤维滤纸（圆周 2.4cm）； 将备有玻璃纤维滤纸的古氏坩锅装在抽滤装置上，把滤纸放在板中央，并用 50mL 左右 水洗涤，在通风烘箱内于 125℃下干燥古氏坩锅 30min，然后移入干燥器内冷却称重。 ③ 坩锅； ④ 烘箱； ⑤ 茂福炉； ⑥ 500mL 烧杯； ⑦ 100mL 量桶； ⑧ 抽滤装置； ⑨ 干燥器。 （三）试剂 ① 稀硝酸，加 1 体积浓硝酸于 4 体积水中
注： 避免热风，防止磷酸盐水解。 用同法将标准参比液 3μL 点在同一块板上，距样品点 1～1.5cm，距板底距离与样品点 一致打开层析缸盖，迅速而小心地把点过样的薄层板放入缸中，盖上盖，避光在室温下展开。 展开到溶剂前沿上升约 10cm 处，取出薄层板，放进烘箱中干燥 10min（可在室温下干燥 30min 或用吹风机冷风档吹干）。 5．碳酸盐的检验 展开过的薄层板立在通风橱中，用喷雾器把显色剂Ⅰ均匀地喷到板上，出现黄斑。用吹 风机吹干簿层板，放进 100℃烘箱至少烘 1h，把硝酸全部除去。薄层板冷却至室温，再放入 通风橱中，喷显色剂Ⅱ，出现明显的蓝斑。 注： 不是绝对要喷显色剂Ⅱ，但此显色剂产生强烈的蓝斑可提高检测效果。 同一试样进行两次检验。 （五）结果的表示 将试样的斑点与磷酸盐标准参比混合液斑点移动距离相比较。 标准参比混合液磷酸盐的 Rf 值见下表 名 称 正磷酸盐 焦磷酸盐 三聚磷酸盐 六偏磷酸盐 Rf 0.70～0.80 0.35～0.50 0.20～0.30 0 一般在肉和肉制品中提取磷酸盐的 Rf 值偏低。 注：可用鲜肉的提取液校正磷酸盐的 Rf 值，鲜肉中只含正磷酸盐。 二、化学分析法 （一）原理： 测定磷酸盐时，先将不完全干燥的样品灰化，然后使磷酸盐水解为正盐，再以磷相酸喹 啉形成离析出来。 首先，将磷酸盐生成磷铝酸（有柠檬酸盐存在时），然后磷铝酸再与碱、喹啉形成磷铝 酸喹啉，柠檬酸能与铵离子结合，阻止磷锃酸铵沉淀的出现。 最初，测定时需要制备两种溶液，以生成磷铝酸喹啉沉淀，即柠檬酸——铝酸溶液和喹 啉溶液，后来使用了丙酮，使这种溶液合二为一，即可用一种试剂作为沉淀剂，我们把该种 沉淀剂称为喹铝柠酮试剂，它是由混合物中的铝酸盐，柠檬酸盐和丙酮的英文名字的字头命 名的。 （二）仪器 ① 古氏坩锅（coors4 号）（布氏漏斗）； ② 玻璃纤维滤纸（圆周 2.4cm）； 将备有玻璃纤维滤纸的古氏坩锅装在抽滤装置上，把滤纸放在板中央，并用 50mL 左右 水洗涤，在通风烘箱内于 125℃下干燥古氏坩锅 30min，然后移入干燥器内冷却称重。 ③ 坩锅； ④ 烘箱； ⑤ 茂福炉； ⑥ 500mL 烧杯； ⑦ 100mL 量桶； ⑧ 抽滤装置； ⑨ 干燥器。 （三）试剂 ① 稀硝酸，加 1 体积浓硝酸于 4 体积水中
② 喹铝柠酮试剂：在 150mL 水中溶解 70g 二水合铝酸钠，在 85mL 硝酸和 150mL 水 的混合液中溶解 60g 柠檬酸并冷却，边搅拌边缓缓将铝酸钠溶液倒入柠檬酸——硝酸溶液 中，溶解 5mL 合成喹啉于 35mL 浓硝酸和 100mL 的混合液中，不时搅拌，并缓缓将其加到 锃酸一硝酸溶液中，混合均匀，放置 24 小时后过滤，向滤液中加 280mL 丙酮，并用水稀释 至 1 升，混合，存于无色的聚乙稀瓶中或深棕色玻璃瓶中。 （四）实验步骤 ① 准确称取 2.5g 样品（样品中 P2O5 的含量不超过 25mg），不用于灰化的坩锅中，并 在通风烘箱内于 125℃下干燥 30min，在 550℃下灰化至成为白色或接近白色为止。 ② 冷却，向灰化坩锅中加入25mL 稀硝酸，在蒸汽浴中加热30min，过滤，收集滤液于400mL 烧杯中，用蒸馏水清洗灰化坩锅和滤纸，使烧杯内收集的滤液总体积为 100mL 左右。 从这一步开始要用25mL稀硝酸和 75mL 蒸馏水做一试剂空白平行试验。加 50mL喹铝柠酮 试剂于盛滤液的烧杯中，盖上表面皿并煮沸1min（不要用明火）。悉心搅拌，冷却至室温。 ③ 将沉淀移入与抽滤装置相连的古氏坩锅内，并分别用 25mL 蒸馏水洗涤 5 次，每次 洗涤水彻底排干后，再加下一部分水洗。 ④ 在 125℃下使古氏坩锅和锅内收集物干燥 30min，移入干燥器中冷却，称重。 （五）计算： 磷含量（%）= 0.0106 C 100 (A B) 0.014 − − 式中： A——样品沉淀物的重量 B——空白测定物重量 C——样品重量 0.014（重量换算因数）= 2212.7( ) 30.97( ) 磷铝酸喹啉分子量 磷的原子量 00106——肉蛋白质中天然的磷含量的校正因数 下表为磷换算为磷酸盐的校正因数 名 称 化 学 式 校正因数 磷酸氢二钠 Na2HPO4 4.58 六偏磷酸钠 (NaPO3)6 3.29 三聚磷酸钠 Na5PO10 3.96 焦磷酸 Na4P2O7 4.29 磷酸二氢钠 NaH2PO4 3.87 焦磷酸二氢钠 NaH2P2O7 3.58
② 喹铝柠酮试剂：在 150mL 水中溶解 70g 二水合铝酸钠，在 85mL 硝酸和 150mL 水 的混合液中溶解 60g 柠檬酸并冷却，边搅拌边缓缓将铝酸钠溶液倒入柠檬酸——硝酸溶液 中，溶解 5mL 合成喹啉于 35mL 浓硝酸和 100mL 的混合液中，不时搅拌，并缓缓将其加到 锃酸一硝酸溶液中，混合均匀，放置 24 小时后过滤，向滤液中加 280mL 丙酮，并用水稀释 至 1 升，混合，存于无色的聚乙稀瓶中或深棕色玻璃瓶中。 （四）实验步骤 ① 准确称取 2.5g 样品（样品中 P2O5 的含量不超过 25mg），不用于灰化的坩锅中，并 在通风烘箱内于 125℃下干燥 30min，在 550℃下灰化至成为白色或接近白色为止。 ② 冷却，向灰化坩锅中加入25mL 稀硝酸，在蒸汽浴中加热30min，过滤，收集滤液于400mL 烧杯中，用蒸馏水清洗灰化坩锅和滤纸，使烧杯内收集的滤液总体积为 100mL 左右。 从这一步开始要用25mL稀硝酸和 75mL 蒸馏水做一试剂空白平行试验。加 50mL喹铝柠酮 试剂于盛滤液的烧杯中，盖上表面皿并煮沸1min（不要用明火）。悉心搅拌，冷却至室温。 ③ 将沉淀移入与抽滤装置相连的古氏坩锅内，并分别用 25mL 蒸馏水洗涤 5 次，每次 洗涤水彻底排干后，再加下一部分水洗。 ④ 在 125℃下使古氏坩锅和锅内收集物干燥 30min，移入干燥器中冷却，称重。 （五）计算： 磷含量（%）= 0.0106 C 100 (A B) 0.014 − − 式中： A——样品沉淀物的重量 B——空白测定物重量 C——样品重量 0.014（重量换算因数）= 2212.7( ) 30.97( ) 磷铝酸喹啉分子量 磷的原子量 00106——肉蛋白质中天然的磷含量的校正因数 下表为磷换算为磷酸盐的校正因数 名 称 化 学 式 校正因数 磷酸氢二钠 Na2HPO4 4.58 六偏磷酸钠 (NaPO3)6 3.29 三聚磷酸钠 Na5PO10 3.96 焦磷酸 Na4P2O7 4.29 磷酸二氢钠 NaH2PO4 3.87 焦磷酸二氢钠 NaH2P2O7 3.58