第一部分 肉与肉制品化学指标测定实验 实验三 肉与肉制品中蛋白质含量的测定（凯氏定氮法） 一、原理 在凯氏定氮过程中，样品中的蛋白质和其他有机成分在催化剂存在下，被硫酸消化，总 有机氮转化成硫酸铵，然后碱化蒸馏，中和消化液使氨游离，并将氨蒸馏至硼酸溶液中形成 硼酸铵，用标准酸溶液滴定，测出样品转化后的氮含量。由于非蛋白组分中也含有氮，所以 此方法的分析结果为样品中的粗蛋白含量。 二、试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制 1．硫酸铜，消化过程中加入硫酸铜是为了增加反应速度，硫酸铜可以起催化剂的作用。 2．硫酸钾，在消化过程中添加硫酸钾，它可与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温 度（纯硫酸沸点 330℃，添加硫酸钾后，可达 400℃），加速反应过程。 3．硫酸。 4．2%硼酸溶液。 5．混合指示剂，1 份 0.1%甲基红乙醇溶液与 5 份 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。 也可用 2 份 0.1%甲基红乙醇溶液与 1 份 0.1%次甲基兰乙醇溶液临用时混合。 6．0.05N 硫酸标准溶液或盐酸标准溶液。 三、仪器 凯氏定氮蒸馏装置，分析天平，凯氏烧瓶，酸式滴定管，容量瓶（100mL），量桶（100mL）， 20mL 吸管，托盘天平，10mL 吸管，三角烧瓶。 四、操作方法 1．样品处理 精密称取 0.2-2.0g 固体样品或 2-5g 半固体样品或吸取 10-20mL 液体样品（含氮量 5～ 80mg），准确至 0.0002g，肉及肉制品取样量为 0.8-1.2 克。移入干燥的 100mL 或 500mL 定 氮瓶中，加入 0.2g 硫酸铜，3g 硫酸钾及 20mL 硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45℃角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火 力（360～410℃），并保持瓶内液体微沸至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热 0.5hr。取 下放冷，小心加 20mL 水，放冷后，移入 100mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并 图 1 凯氏蒸馏装置 蒸 汽 发 生 器 安全管 导管 汽水分离器 样品入口 冷凝管 冷水 接收三角瓶 反应管
第一部分 肉与肉制品化学指标测定实验 实验三 肉与肉制品中蛋白质含量的测定（凯氏定氮法） 一、原理 在凯氏定氮过程中，样品中的蛋白质和其他有机成分在催化剂存在下，被硫酸消化，总 有机氮转化成硫酸铵，然后碱化蒸馏，中和消化液使氨游离，并将氨蒸馏至硼酸溶液中形成 硼酸铵，用标准酸溶液滴定，测出样品转化后的氮含量。由于非蛋白组分中也含有氮，所以 此方法的分析结果为样品中的粗蛋白含量。 二、试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制 1．硫酸铜，消化过程中加入硫酸铜是为了增加反应速度，硫酸铜可以起催化剂的作用。 2．硫酸钾，在消化过程中添加硫酸钾，它可与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温 度（纯硫酸沸点 330℃，添加硫酸钾后，可达 400℃），加速反应过程。 3．硫酸。 4．2%硼酸溶液。 5．混合指示剂，1 份 0.1%甲基红乙醇溶液与 5 份 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。 也可用 2 份 0.1%甲基红乙醇溶液与 1 份 0.1%次甲基兰乙醇溶液临用时混合。 6．0.05N 硫酸标准溶液或盐酸标准溶液。 三、仪器 凯氏定氮蒸馏装置，分析天平，凯氏烧瓶，酸式滴定管，容量瓶（100mL），量桶（100mL）， 20mL 吸管，托盘天平，10mL 吸管，三角烧瓶。 四、操作方法 1．样品处理 精密称取 0.2-2.0g 固体样品或 2-5g 半固体样品或吸取 10-20mL 液体样品（含氮量 5～ 80mg），准确至 0.0002g，肉及肉制品取样量为 0.8-1.2 克。移入干燥的 100mL 或 500mL 定 氮瓶中，加入 0.2g 硫酸铜，3g 硫酸钾及 20mL 硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45℃角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火 力（360～410℃），并保持瓶内液体微沸至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热 0.5hr。取 下放冷，小心加 20mL 水，放冷后，移入 100mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并 图 1 凯氏蒸馏装置 蒸 汽 发 生 器 安全管 导管 汽水分离器 样品入口 冷凝管 冷水 接收三角瓶 反应管
入容量瓶中。再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同 一方法做试剂空白试验。 2．装置凯氏定氮蒸馏装置 按图装好定氮蒸馏装置，在水蒸汽发生瓶内装水至约 2/3 处，加甲基红指示液数滴及数 毫升硫酸，以保持水呈酸性。加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水 3．半微量蒸馏 向锥形瓶内加入 10mL2%硼酸溶液及混合指示液 1 滴。并使冷凝管的下端浸入液面下。 准确移取样品消化液 10mL 注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，立即将 夹子夹紧，再加 10mL 氢氧化钠溶液，小心松动夹子使之流入反应室，将夹子夹紧，且在入 口处加水密封，防止漏气。蒸馏 5min 降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏 lmin， 用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。取下接收瓶，以滴定至为 终点。 4．滴定 蒸馏后的吸收液立即用 0.05mol／L 硫酸或 0.05mol／L 盐酸标准溶液（邻苯二甲酸氢钾 法标定）滴定，溶液由蓝绿色变成灰色或灰红色为终点。 同时吸取 10mL 空白液按上述方法蒸馏。 5．计算 100 V V m (v v ) c 0.0140 6.25 (%) 2 1 − 粗蛋白质 = 式中：v2——滴定样品时所需标准酸溶液体积，mL； v1——滴定空白样品时所需标准酸溶液体积，mL； c——盐酸标准溶液浓度，mol／L； m——试样质量，g； V——试样消化液总体积，mL； V′——试样消化液蒸馏用体积，mL； 0.0140——与1.00mL盐酸标准溶液（1.000mol／L）相当的、以克表示的氮的质量。 6.25——氮换算成蛋白质的平均系数。蛋白质中氮含量一般为 15—17.6%，按 16%计 算乘以 6.25 即为蛋白质。肉与肉制品为 6.25，乳制品为 6.38，白粉为 5.70，玉米、高梁为 6.24，大豆及其制品为 5.71。 6．重复性要求 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋白质含量在 25％以上时，允许相对偏差为１％。 当粗蛋白质含量在 10％～25％之间时，允许相对偏差为 2％。 当粗蛋白质含量在 10％以下时，允许相对偏差为 3％。 五、凯氏定氮法的优缺点 优点 ①可用于所有食品的蛋白质分析中； ②操作相对比较简单； ③实验费用较低； ④结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法； ⑤用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质 缺点 ①最终测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮；
入容量瓶中。再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同 一方法做试剂空白试验。 2．装置凯氏定氮蒸馏装置 按图装好定氮蒸馏装置，在水蒸汽发生瓶内装水至约 2/3 处，加甲基红指示液数滴及数 毫升硫酸，以保持水呈酸性。加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水 3．半微量蒸馏 向锥形瓶内加入 10mL2%硼酸溶液及混合指示液 1 滴。并使冷凝管的下端浸入液面下。 准确移取样品消化液 10mL 注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，立即将 夹子夹紧，再加 10mL 氢氧化钠溶液，小心松动夹子使之流入反应室，将夹子夹紧，且在入 口处加水密封，防止漏气。蒸馏 5min 降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏 lmin， 用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。取下接收瓶，以滴定至为 终点。 4．滴定 蒸馏后的吸收液立即用 0.05mol／L 硫酸或 0.05mol／L 盐酸标准溶液（邻苯二甲酸氢钾 法标定）滴定，溶液由蓝绿色变成灰色或灰红色为终点。 同时吸取 10mL 空白液按上述方法蒸馏。 5．计算 100 V V m (v v ) c 0.0140 6.25 (%) 2 1 − 粗蛋白质 = 式中：v2——滴定样品时所需标准酸溶液体积，mL； v1——滴定空白样品时所需标准酸溶液体积，mL； c——盐酸标准溶液浓度，mol／L； m——试样质量，g； V——试样消化液总体积，mL； V′——试样消化液蒸馏用体积，mL； 0.0140——与1.00mL盐酸标准溶液（1.000mol／L）相当的、以克表示的氮的质量。 6.25——氮换算成蛋白质的平均系数。蛋白质中氮含量一般为 15—17.6%，按 16%计 算乘以 6.25 即为蛋白质。肉与肉制品为 6.25，乳制品为 6.38，白粉为 5.70，玉米、高梁为 6.24，大豆及其制品为 5.71。 6．重复性要求 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋白质含量在 25％以上时，允许相对偏差为１％。 当粗蛋白质含量在 10％～25％之间时，允许相对偏差为 2％。 当粗蛋白质含量在 10％以下时，允许相对偏差为 3％。 五、凯氏定氮法的优缺点 优点 ①可用于所有食品的蛋白质分析中； ②操作相对比较简单； ③实验费用较低； ④结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法； ⑤用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质 缺点 ①最终测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮；
②实验时间太长(至少需要 2h 才能完成)； ③精度差，精度低于双缩脲法； ④所用试剂有腐蚀性
②实验时间太长(至少需要 2h 才能完成)； ③精度差，精度低于双缩脲法； ④所用试剂有腐蚀性