ICS GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19681-2005 食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 The method for the determination of Sudan dyes in foods- High performance liquid chromatography 2005-03-29发布 2005-03-29实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会
ICS 中华人民共和国国家标准 GB/T 19681—2005 食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 The method for the determination of Sudan dyes in foods – High performance liquid chromatography 2005-03-29 发布 2005-03-29 实施 国家质量监督检验检疫总局 国家标准化管理委员会 发布
GBVT19681-2005 前 言 本标准进循G讯/T1.1-2000(标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则)和CB/T20001.4-200] 《标准编写规则第4部分，化学分析方法》的编写规则。 本标准的附录A为贵料性附录。 本标准由国家质量监督检险检疫总局提出： 本标涂由国家粮食质量蓝督检验中心归口。 本标准起草单位，国家酿食质量监督检验中心，大连市产品质量监督检险所。 本标准主要起草人：潘韩、王存瓶、李鹏、董广彬、于利军
GB/T 19681—2005 I 前 言 本标准遵循GB/T1.1-2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001 《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》的编写规则。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准由国家粮食质量监督检验中心归口。 本标准起草单位：国家粮食质量监督检验中心，大连市产品质量监督检验所。 本标准主要起草人：潘炜、王春燕、李鹏、董广彬、于利军
GBrT19%81-2005 食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法 1范国 本标准话用于食品中苏丹红染料的检测。 本标准规定了食品中苏丹红【、苏丹红Ⅱ、苏丹红川、苏丹红V的高效液相色游测定方法。 方法最低检测限：苏丹红1，苏丹红Ⅱ，苏丹红、苏丹红N均为10g/小。 2术语和定文 2.1苏丹红 属偶氯系列化工合成染料。 3方法要点 样品经溶剂提取、国相萃取净化后，用反相高效液相色谱一紫外可见光检测器进行色语分析，采用 外标法定量。 ◆试剂与标准品 4.1乙精色清纯 4.2内丽色端饨、分析饨 43甲酸分析纯 4.4乙醚分析纯 4.5正己烷分析纯 4.6无水硫酸钠分析纯 4.7层析柱管：1em(内径)×5c倒高)的注射器管。 4.8层析用氧化铝（中性100目一200目》：105℃干燥2h,于干燥墨中冷至室温，每100g中 加入2L水降活，混匀后密封，放置12西后使用. 注：不同厂家和不同就号氧化阳的话度有差异，溪根摇具体购置的氧亿侣产品略作调整，活度的调整采用标准溶液 过柱，将1/L.的苏再红的混合标准谢液1L如到柱中，用5丙酮正己烷第液63L完全法脱为准，4种苏再红在层析 柱上的流出顺序为落丹红口，苏丹红V、苏丹红1：基月红旧。可根据每种落丹红的曰收率作出判断。寿丹红川、养丹 红V的同收率较低表明氧化智括性偏低。苏丹红川的风收率偏低时表明括性偏高。 4.9氧化铝层析柱：在层析柱管底部事入一湖层脱霜棉。干法装入处理过的氧化铝至3m高，轻 敲实后加一薄层脱脂棉，用10正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。 4.105%丙酮的正己流液：吸取50mL丙酮用正己统定容至L。 4.11标准物质：苏丹红1、苏丹红川、苏丹红川、苏并红W:纯度395% 4.12标准贮备液：分别移取苏丹红I、葛丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红N各1Q0g(按实际含量折 算)，用乙醒济解后用止已烷定容至250L. 5佼器与设备 51高效液相色诺仪《配有紫外可见光松测器)
GB/T 19681—2005 1 食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 1 范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测。 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法。 方法最低检测限：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ均为 10 ug/kg 。 2 术语和定义 2.1 苏丹红 属偶氮系列化工合成染料。 3 方法要点 样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱—紫外可见光检测器进行色谱分析，采用 外标法定量。 4 试剂与标准品 4.1 乙腈 色谱纯 4.2 丙酮 色谱纯、分析纯 4.3 甲酸 分析纯 4.4 乙醚 分析纯 4.5 正己烷 分析纯 4.6 无水硫酸钠 分析纯 4.7 层析柱管：1cm（内径）× 5cm(高)的注射器管。 4.8 层析用氧化铝（中性 100 目～200 目）： 105℃ 干燥 2h，于干燥器中冷至室温，每 100g 中 加入 2mL 水降活，混匀后密封，放置 12h 后使用。 注：不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液 过柱，将 1ug/mL 的苏丹红的混合标准溶液 1mL 加到柱中，用 5%丙酮正己烷溶液 60mL 完全洗脱为准，4 种苏丹红在层析 柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹 红Ⅳ的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红Ⅲ的回收率偏低时表明活性偏高。 4.9 氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至 3 cm 高，轻 敲实后加一薄层脱脂棉，用 10mL 正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。 4.10 5%丙酮的正己烷液：吸取 50mL 丙酮用正己烷定容至 1L。 4.11 标准物质：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ；纯度≥95% 4.12 标准贮备液：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各 10.0mg（按实际含量折 算），用乙醚溶解后用正己烷定容至 250mL。 5 仪器与设备 5.1 高效液相色谱仪（ 配有紫外可见光检测器）
GB/T19681-2005 5.2分析天平：感量0.1mg 53旋转蒸发仪 5.4均质机 5.5离心机 5.60.45■m有机滤腰 6样是制备 将液体、浆状样品混合均匀，园体样品需磨细。 7操作方法 7.1样品处理 7.1.1红辣短松等粉状样品 称取1g一5g(准确至0.001g)样品于三角瓶中，如入10L.一30ml正己烷，超声5min。过滤，用10al 正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色。合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至✉以下，慢慢加入氧化督 层析柱中(4.9)，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2■左右时上样，在全程的层析过程中不 应使柱干礼，用正己烷少量多汝淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表层吸附的色素梦宽宜小于 Q,5m,特样液完全流出后，祝样品中含油类杂质的多少用10L~30l正己烷洗柱。直至流出液无色， 弃去全部正已烷淋洗液。用含5丙酮的正已烷液60L(4.10)洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容 至5L,经0.45μ■有机滤履过滤后特测。 7.1.2红辣瓶油，火蜗料。奶油等油状样品 称取0.5g一2g(准确至0.001g)样品于小烧杯中，加入适量正己烷溶解（约1山一10L),难溶解 的样品可于正己烷中加温溶解。按7.11中“慢慢加入到氧化船层析柱过滤后特测”操作。 7.1.3辣粗酱、香指沙司等含水量较大的样品 称取10x一20g(准确至0.01g)样品于离心管中，加101.一20L水将其分散成颗状，含增剩剂的样 品多加水，加入30正己规：丙酮=3,1。匀浆5a1n,3000pm离心10ain,吸出正己饶层，于下层再 加入20L×2次正已烷匀浆，离心，合并3次正己烷。如入无水萄酸销5g殿水，过滤后于转隔爱仪上 蒸干并保持5分钟，月5.正己烷溶解残流后，按7.1.1中“慢慢加入到氧化帽层斯柱过滤后特测” 操作。 7.1.4香肠等肉制品 称取松醉样品10g-20w(准确至0.01x)于三角瓶中，加入60正己烷充分匀浆ain,浅出清液， 再以20，×2次正己烷匀浆，过滤，合并3次滤液，加入5x无水硫酸销脱水，过滤后于旋转蒸发像上蒸至 5L以下，按7.1,1中“慢慢加入到氧化铝层析柱中一过花后特测”操作。 7.2推荐色带条件 7,2.1仪器条件 ■色谱桂：Zorbax SB-C183.5μ■4,6em×150m(或相当型号色讲柱) 。流动相： 一溶剂A0.1%甲酸的水溶液！乙睛=85115 一溶剂B0.1%甲酸的乙睛溶液：丙解0：20 ■梯度流脱：流速：Iml/min柱温：30℃检测波长：苏丹红【478m苏丹红Ⅱ、苏丹红I川 苏丹红V520m:于苏丹红I出峰后切换。进样量10μ1。梯度条件见表1。 7.2.2标准曲线 吸取标准储备液0、0.1.0.2、.0.4.0.8、1.8.，用正己烷定容至25l,此标准系列浓度为0、0.16、 0,32、0,64、1.28、256μ/L,绘制标准由线。 7.3计算
GB/T 19681—2005 2 5.2 分析天平：感量 0.1mg 5.3 旋转蒸发仪 5.4 均质机 5.5 离心机 5.6 0.45μm 有机滤膜 6 样品制备 将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需磨细。 7 操作方法 7.1 样品处理 7.1.1 红辣椒粉等粉状样品 称取1 g～5g（准确至0.001g）样品于三角瓶中，加入10mL～30mL正己烷，超声5min，过滤，用10mL 正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝 层析柱中（4.9），为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不 应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10mL～30mL正己烷洗柱，直至流出液无色， 弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60mL（4.10）洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容 至5mL，经0.45μm有机滤膜过滤后待测。 7.1.2 红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品 称取0.5 g～2g（准确至0.001g）样品于小烧杯中，加入适量正己烷溶解（约1 mL～10mL），难溶解 的样品可于正己烷中加温溶解。按7.1.1中“慢慢加入到氧化铝层析柱……过滤后待测”操作。 7.1.3 辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品 称取10 g～20g（准确至0.01g）样品于离心管中，加10mL～20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样 品多加水，加入30mL正己烷：丙酮 = 3：1，匀浆5min, 3000rpm离心10min, 吸出正己烷层，于下层再 加入20mL×2次正己烷匀浆，离心，合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g 脱水，过滤后于旋转蒸发仪上 蒸干并保持5分钟，用5mL正己烷溶解残渣后，按7.1.1中“慢慢加入到氧化铝层析柱……过滤后待测” 操作。 7.1.4 香肠等肉制品 称取粉碎样品10g～20g（准确至0.01g）于三角瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5min，滤出清液， 再以20mL×2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL以下，按7.1.1中“慢慢加入到氧化铝层析柱中……过滤后待测”操作。 7.2 推荐色谱条件 7.2.1 仪器条件 色谱柱： Zorbax SB-C18 3.5 μm 4.6mm×150mm （或相当型号色谱柱） 流动相： 溶剂 A 0.1%甲酸的水溶液：乙腈 = 85：15 溶剂 B 0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20 梯度洗脱：流速:1mL/min 柱温：30℃ 检测波长：苏丹红Ⅰ 478nm ；苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、 苏丹红Ⅳ 520nm ；于苏丹红Ⅰ出峰后切换。进样量 10μl。梯度条件见表 1。 7.2.2 标准曲线 吸取标准储备液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL ，用正己烷定容至25mL，此标准系列浓度为0、0.16、 0.32、0.64、1.28、2.56μg/mL,绘制标准曲线。 7.3 计算
GBwT19681-2005 按公式(1)计算苏丹红含量 R-OxyM…(1) A一样品中苏丹红含量，单位为毫克每千克(/kg力 一由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为微克每毫升(“/L): 一样液定容体积。单位为毫升（山方 上-样品质量，单位为克(g)。 表】梯度条件 时间(ain》 流诗相 由线 AX B% 0 25 5 线性 100 25 5 线性 2五0 100 线性 320 180 线性 350 奶 5 线性 400 25 5 线性 3
GB/T 19681—2005 3 按公式（1）计算苏丹红含量 R=C×V /M ······（1） R—样品中苏丹红含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； C—由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)； V—样液定容体积，单位为毫升（mL）； M—样品质量，单位为克（g）。 表 1 梯度条件 流动相 时间（min） A％ B％ 曲线 0 25 75 线性 10.0 25 75 线性 25.0 0 100 线性 32.0 0 100 线性 35.0 25 75 线性 40.0 25 75 线性
GBrT19%81-2005 附录A (资料性附录) 苏丹红标准色谱图 4
GB/T 19681—2005 4 附录 A （资料性附录） 苏丹红标准色谱图 ———————————— 0 5 10 15 20 25 30 35 min mAU 0 1 2 3 4 VWD1 A, Wavelength=476 nm (SUDAN4\05030307.D) 5.752 10.506 15.517 21.870 Sudan I Sudan II Sudan III Sudan IV