1C867.12030 B50 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 Determination of malachite green and crystal violet residues in aquatic product 2005-09-05发布 2005-09-05实施 中华人民共和因因家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会
1 ICS 67.120.30 B 50 中华人民共和国国家标准 GB/T 19857—2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 Determination of malachite green and crystal violet residues in aquatic product 2005-09-05 发布 2005-09-05 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 国 家 标 准 化 管 理 委 员会
GB/T198572005 前 言 本标准附录为资料性阳录。 本标准由全国水产标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、厦门出入境检验检疫局、广东出入境检 验检疫局、剂建出入境检验检夜局，江苏出入境检验检疫局、北嘉出入境检验检夜局，宁波出入境检验 检及具。 本标准主要起草人：郭德华、能冰、杨惠琴、林峰、李波、张志刚、林春丹、王传现、倦魔平。 露永刚、李耀平、杨芳、陈惠兰、张朝晖、殿居易、林立毅、袁辰刚： 本标准系首次发布的国家标液
GB/T19857—2005 I 前 言 本标准附录为资料性附录。 本标准由全国水产标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、厦门出入境检验检疫局、广东出入境检 验检疫局、福建出入境检验检疫局、江苏出入境检验检疫局、北京出入境检验检疫局、宁波出入境检验 检疫局。 本标准主要起草人： 郭德华、施冰、杨惠琴、林峰、李波、张志刚、林海丹、王传现、陈鹭平、 盛永刚、李耀平、杨芳、陈惠兰、张朝晖、殷居易、林立毅、袁辰刚。 本标准系首次发布的国家标准
GB/T19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 1范围 本标准线定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔衡石绿(Leuconalachite green)、结品紫及其 代谢物隐色结品紫Leucocrystal v1olt)残留量的液相色游-串联质谱和高效液相色谱的测定方法。 本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔霍石探及其代谢物险色孔雀石绿，结品兼及其代谢物隐色结 品紫残面量的检验。 2液相色谱一串联质请法 2.1原理 试样中的残留物用乙晴一乙醒按援神溶液提取，乙明再次提取后，液液分配到二氯甲烧左层，经中性 氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色游-串联质谱法测定，内标法定量。 2.2试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。 22.1乙睛：液相色谐纯。 2.2.2甲醇：液相色谱纯。 2.2.3二氯甲烧， 2.2.4无水乙酸按。 2.2.550lL乙酸该缓冲溶液：称取385g无水乙酸核溶解于90L水中，冰乙酸博l到7.0，用水 定客至100L。 2.2.60.1o1/L乙酸技援冲溶液：称取7.71g无水乙酸皎溶解于1000L水中，冰乙酸调由到4.5. 2.2.750lL乙酸被缓冲溶液：称取0.3g5g无水乙酸该溶解于1000l.水中，冰乙酸测l到4.5， 过0.2州滤腹。 2.2.8冰乙酸. 2.2.90.25g/l.盐酸2饿溶液， 2.2.101.001/L对-甲苯碳酸溶液：称取17.2g对-甲苯销酸，用水溶解并定客至100L. 2.2.112%(r/w)甲酸溶液. 22,125路(v/w)乙酸按甲醇溶液：量取5l乙酸陂缓冲溶液2.2.5)用甲醇定容至100 2.2.13阳离子交换柱：C,60g/3L,使用前依次用3L乙睛、3L甲酸溶液(2.2.11)活化 2.2.14中性氧化柱：1g/3aL,使用前用5L乙精话化. 22.15标准品：孔蛋石绿（斯），隐色孔金石绿(L%),结品新(CV)、②色结晶紫(LCV),同位 素内标氟代孔霍石绿《D·斯)、同位素内标氣代隐色孔雀石绿(D·LG)，纯度大于9路 2216标准储备溶液：准确称取适量的孔霍石禄，隐色孔霍石绿，结晶紫，隐色结品餐、氟代孔蜜石 绿、氟代隐色孔雀石绿标准品。用乙睛分别配制成100g/L的标准贮备液。 2.2.17混合标准储备溶液(1/L)：分别准确吸取1.0L孔霍石绿、结品紫、隐色孔霍石绿和隐 色结晶紫的标准储备溶液(22,16)至100L容量瓶中，用乙睛稀释至刻度，1L该溶液分测含1% 的孔重右绿、结品紫、隐色孔雀石绿和隐色结品紫。一18℃避光保存。 2.2.18混合标准锦备溶液(100e/L):用乙睛稀释湿合标准储备溶液(2.2.17)，配制成每毫升含 孔瓷石绿、隐色孔霍石绿、结品紫、隐色结品紫均为100g的混合标准储备溶液。-18℃避光保存
GB/T19857—2005 1 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 1 范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachite green）、结晶紫及其 代谢物隐色结晶紫(Leucocrystal violet)残留量的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱的测定方法。 本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结 晶紫残留量的检验。 2 液相色谱-串联质谱法 2.1 原理 试样中的残留物用乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层，经中性 氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。 2.2 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。 2.2.1 乙腈：液相色谱纯。 2.2.2 甲醇：液相色谱纯。 2.2.3 二氯甲烷。 2.2.4 无水乙酸铵。 2.2.5 5mol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取 38.5g 无水乙酸铵溶解于 90mL 水中，冰乙酸调 pH 到 7.0, 用水 定容至 100mL。 2.2.6 0.1mol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取 7.71g 无水乙酸铵溶解于 1000mL 水中，冰乙酸调 pH 到 4.5。 2.2.7 5mmol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取 0.385g 无水乙酸铵溶解于 1000mL 水中，冰乙酸调 pH 到 4.5， 过 0.2µm 滤膜。 2.2.8 冰乙酸。 2.2.9 0.25g/mL 盐酸羟铵溶液。 2.2.10 1.0mol/L 对-甲苯磺酸溶液: 称取 17.2g 对-甲苯磺酸，用水溶解并定容至 100mL。 2.2.11 2%（v/v）甲酸溶液。 2.2.12 5%（v/v）乙酸铵甲醇溶液：量取 5mL 乙酸铵缓冲溶液(2.2.5)用甲醇定容至 100mL。 2.2.13 阳离子交换柱：MCX，60mg/3mL，使用前依次用 3mL 乙腈、3mL 甲酸溶液（2.2.11）活化。 2.2.14 中性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用 5 mL 乙腈活化。 2.2.15 标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV）、同位 素内标氘代孔雀石绿（D5 – MG）、同位素内标氘代隐色孔雀石绿（D6 – LMG），纯度大于 98%。 2.2.16 标准储备溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、氘代孔雀石 绿、氘代隐色孔雀石绿标准品，用乙腈分别配制成 100µg/mL 的标准贮备液， 2.2.17 混合标准储备溶液（1µg/mL）：分别准确吸取 1.00 mL 孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐 色结晶紫的标准储备溶液（2.2.16）至 100 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，1mL 该溶液分别含 1µg 的孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫。-18℃避光保存。 2.2.18 混合标准储备溶液（100ng/mL）：用乙腈稀释混合标准储备溶液（2.2.17），配制成每毫升含 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为 100ng 的混合标准储备溶液。-18℃避光保存
GB/T19857-2005 2.219混合内标标准溶液：用乙精稀释标准溶液(2,2.16)，配制成每毫升含氘代孔霍石绿和氘代隐 色孔重石绿各100g的内标混合溶液。-18℃避光保存。 2.2.20混合标准工作溶液：根据需要，临用时吸取一定量的混合标准储备溶液(2.2.18)和混合内标 标准溶液(22,19)，用乙睛-501/几乙酸陵溶液(1+1)稀释配制适当浓度的混合标准工作液。每毫 升该混合标准工作溶液含有氟代孔霍石绿和氟代隐色孔金右绿各2g。 2.3仪器和设备 231高效液相色串联质请联用仪：配有电喷雾(E5)离子源。 23.2匀浆机， 2.3.3离心机：4000r/ain. 2.3.4超声波水济。 235能洞振落器。 2.3.6D浓增瓶，25aL. 2.3.7周相萃取装置。 2.3.8旋转摄发仪 2.4样品制备 24.1鲜活水产品 a)提取 称取5.00x已热碑样品于50✉L离心管中，加入200μL混合内标标准溶液(22.19》，加入11l.乙睛， 超声波振荡提取2ain,8000r/■fn匀浆提取30s,4000r/ain离心5fn,上请液转移至25aL比色管中： 另取50L离心管加入11山乙精，就涤匀亲刀头10s,洗涤液移入前一离心管中，用玻棒挎碎离心管中 的沉淀，澈洞湿匀墨上振落30s,超声波振荡5a1n,4000r/min离心5海in,上清液合并至25比色管中， 用乙睛定容至25.0L,摇匀备用. b净化 移取5.00mL样品溶液加至己活化的中性氧化铝柱(22.14》上，用KD浓缩瓶接牧流出液。4mL 乙睛洗涤中性氧化铝柱，收集全都流出液，45℃锭转减爱至约1mL,残液用乙睛定容至1.00mL,超声 振荡3min,加入10ml5mmo1.乙酸陵，超声据高1min,样液经02=m浅模过滤后供液相色游-串联 质游测定。 2.4.2加工水产品 c)提取 称取5.00g已捣碎样品于100L离心管中，加入200μL湿合内标标准溶液(2.2.19)，依次加入1L 盐酸羟胺(2.29)，2L对-甲苯磺酸(22.10)，2L乙酸胺援冲溶液(2.26)和40L乙睛，匀聚 2ain(10000r/ain),高心3ain3000r/ain),将上清液转移到250al分液漏斗中，用20L乙睛重复提取残 渣一次，合并上清液。于分液漏斗中加入30mL二氯甲烷.35水。振超2n:静置分层，收集下层有 机层于150L梨形框中，再用20L二氯甲烷餐取一次，合并二氧甲烷层，5℃旋转藤发近干。 d山净化 将中性氧化相柱(2.214)串接在阳离子交换柱(22.13》上方。用6L乙睛分三次（每次2L), 用装祸震荡器祸奖溶解上述提取物，并依次过桂，控挖制阳离子交换柱流速不超过Q.6L加i,再用 乙睛淋洗中性氧化相柱后，弃去中性氧化智柱。依次用3✉l.2%(v小)甲酸溶液、5ml乙睛淋洗阳离子 交换柱，弃去流出液。用4L5路（￥/v)乙酸按甲醇溶液(2.212）洗脱，洗脱流速为1L/a1,用10L 刻度试管收集洗晚液，用水定客至10.0L,样液经024m滤粮过滤后供液相色进·申联质诗测定。 2.5测定 2.5.1液相色讲-串联质清条件 a)色谱柱：Cw柱，50回×2.1国(i.d.),敕度3ua b)流动相：乙睛+5ol/L乙酸按=T5+25(w/):
GB/T19857—2005 2 2.2.19 混合内标标准溶液：用乙腈稀释标准溶液（2.2.16），配制成每毫升含氘代孔雀石绿和氘代隐 色孔雀石绿各 100ng 的内标混合溶液。-18℃避光保存。 2.2.20 混合标准工作溶液：根据需要，临用时吸取一定量的混合标准储备溶液（2.2.18）和混合内标 标准溶液（2.2.19）,用乙腈-5mmol/L 乙酸铵溶液（1+1）稀释配制适当浓度的混合标准工作液，每毫 升该混合标准工作溶液含有氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿各 2ng。 2.3 仪器和设备 2.3.1 高效液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾（ESI）离子源。 2.3.2 匀浆机。 2.3.3 离心机：4 000 r/min。 2.3.4 超声波水浴。 2.3.5 旋涡振荡器。 2.3.6 KD 浓缩瓶， 25mL。 2.3.7 固相萃取装置。 2.3.8 旋转蒸发仪 2.4 样品制备 2.4.1 鲜活水产品 a) 提取 称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中，加入200µL混合内标标准溶液（2.2.19），加入11mL乙腈， 超声波振荡提取2min，8000r/min 匀浆提取30s，4000 r/min离心5min，上清液转移至25mL比色管中； 另取一50 mL离心管加入11mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中 的沉淀，漩涡混匀器上振荡30s，超声波振荡5min，4 000r/min离心5min，上清液合并至25mL比色管中， 用乙腈定容至25.0mL，摇匀备用。 b) 净化 移取 5.00mL 样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱（2.2.14）上，用 KD 浓缩瓶接收流出液，4mL 乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至约 1mL，残液用乙腈定容至 1.00mL，超声 振荡 5min, 加入 1.0mL5mmol/L 乙酸铵，超声振荡 1min，样液经 0.2μm 滤膜过滤后供液相色谱-串联 质谱测定。 2.4.2 加工水产品 c) 提取 称取5.00g已捣碎样品于100mL离心管中，加入200µL混合内标标准溶液（2.2.19），依次加入1mL 盐酸羟胺(2.2.9)、2mL 对-甲苯磺酸（2.2.10）、2mL 乙酸铵缓冲溶液（2.2.6）和40mL乙腈，匀浆 2min(10000r/min)，离心3min(3000r/min)，将上清液转移到250mL分液漏斗中，用20mL乙腈重复提取残 渣一次，合并上清液。于分液漏斗中加入30ｍＬ二氯甲烷、35mL水，振摇2min，静置分层，收集下层有 机层于150mL梨形瓶中，再用20mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷层，45℃旋转蒸发近干。 d) 净化 将中性氧化铝柱（2.2.14）串接在阳离子交换柱（2.2.13）上方。用 6mL 乙腈分三次（每次 2mL）， 用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物，并依次过柱，控制阳离子交换柱流速不超过 0.6mL/min，再用 2mL 乙腈淋洗中性氧化铝柱后，弃去中性氧化铝柱。依次用 3mL 2%（v/v）甲酸溶液、3mL 乙腈淋洗阳离子 交换柱，弃去流出液。用 4mL 5%（v/v）乙酸铵甲醇溶液 (2.2.12)洗脱，洗脱流速为 1mL/min，用 10mL 刻度试管收集洗脱液，用水定容至 10.0mL，样液经 0.2μm 滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。 2.5 测定 2.5.1 液相色谱-串联质谱条件 a) 色谱柱：C18柱，50mm×2.1mm（i.d.），粒度 3μm； b) 流动相：乙腈 + 5mmol/L 乙酸铵 = 75+25(v/v)；
GB/T19857-2005 c)流速：0.2Lain: 0柱温：35℃： e)进样量：10咖L: )离子尊：电喷雾SI,正离子： 扫描方式：多反应整测M )雾化气、窗附气，辅助如热气、骚撞气均为高纯氯气：使用前应调节各气体流量以使质讲灵敏 度达到检测要求： )政雾电压、去集族电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度： )监测离子对：孔雀石绿/x39/313(定量离子).329/208：②色孔雀石/x331316(定量 离子)，331/239：结品紫m/372/356(定量离子)，372/251：隐色结品紫m/z374/359(定量离子)， 374/238:氘代孔雀石绿/334/318（定量离子）；氘代隐色孔雀石绿/x337/322(定量离子)。 252液相色谱-半联质罐测定 按瓢2.5.1液相色语-中联质进条件测定样品和混合标准工作溶液(2.2.20)，以色语峰面积按内标 法定量，孔霍石绿和结品紫以氘代孔霍石绿为内标物计算，隐色孔霍石绿和②色结品餐以氘代隐色孔 石绿为内标物计算。在上述色游条件下孔霍石绿、氘代孔雀石绿、结品繁、氟代险色孔雀石绿、隐色 孔雀石绿和隐色结品紫的参考保留时间分别为2.27ain,2.30如in.2.83ain.5.21ain.531ain、561min, 标准溶液的离子流图参见用柔A中阁A1。 2.5.3液相色讲-串联质讲确证 按瓢2.5.1液相色语-非联质游条件测定样品和标准工作溶液，分别计算样品和标准工作溶液中非定 量离子对与定量离子对色游峰面积的比值，仅当两者数值的相对偏差小于2时方可确定两者为同一物 质。 2.6空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 2.7结果计算和表述 按式(1)计算样品中孔霍石绿，隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶纸残图量。计算结果蓄扣除空 白值。 CxGxAxAxV = …(1) CaxA.4,xp 式中： 一样品中待测组分残留量，/kg: C一 孔窗石绿、隐色孔霍石绿、结品紫成隐色结品紫标准工作溶液的浓度，/八儿 标准工作溶液中内标物的浓瘦，g几： G一 样液中内标物的浓度，地/L: 孔霍石绿，隐色孔霍石绿，结晶紫成②色结晶紫标准工作溶液的峰面积 样液中孔金石绿、隐色孔蛋石绿、结品紫或隐色结品紫的峰面而积： 28A,一标准工作溶液中内标物的峰南积： 一 样液中内标物的峰面积： 样品定容体机，L: 样品称样量，黑 本方法孔霍石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔霍石绿残留量的之和，以孔霍 石绿表示
GB/T19857—2005 3 c) 流速：0.2mL/min； d) 柱温：35℃； e) 进样量：10µL； f) 离子源：电喷雾ESI，正离子； g) 扫描方式：多反应监测 MRM； h) 雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏 度达到检测要求； i) 喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度； j) 监测离子对：孔雀石绿m/z 329/313（定量离子）、329/208；隐色孔雀石绿m/z 331/316（定量 离子）、331/239; 结晶紫m/z 372/356（定量离子）、372/251；隐色结晶紫m/z 374/359（定量离子）、 374/238；氘代孔雀石绿 m/z 334/318（定量离子）; 氘代隐色孔雀石绿 m/z 337/322（定量离子）。 2.5.2 液相色谱-串联质谱测定 按照2.5.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液（2.2.20），以色谱峰面积按内标 法定量，孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算，隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀 石绿为内标物计算。 在上述色谱条件下孔雀石绿、氘代孔雀石绿、结晶紫、氘代隐色孔雀石绿、隐色 孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为2.27min、2.30min、2.88min、5.21min、5.31min、5.61min， 标准溶液的离子流图参见附录A中图A.1。 2.5.3 液相色谱-串联质谱确证 按照2.5.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，分别计算样品和标准工作溶液中非定 量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值，仅当两者数值的相对偏差小于25%时方可确定两者为同一物 质。 2.6 空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 2.7 结果计算和表述 按式（1）计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结果需扣除空 白值。 C×Ci×A×Asi×V X= …… (1) Csi×Ai×As×W 式中： X ── 样品中待测组分残留量，µg/kg； C ── 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的浓度，µg/L； Csi ── 标准工作溶液中内标物的浓度，µg/L； Ci ── 样液中内标物的浓度，µg/L； As ── 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的峰面积； A ── 样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫的峰面积； 2.8 Asi ── 标准工作溶液中内标物的峰面积； Ai ── 样液中内标物的峰面积； V ── 样品定容体积，mL； W ── 样品称样量，g 本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量的之和，以孔雀 石绿表示
GB/T19857-2005 本方法结品紧的残留量测定结果系指结品紫和它的代离物隐色结品繁残图量的之和，以结品紫表 示， 2,9方法检测限 本方法孔霍石绿、隐色孔雀石绿、结品繁、隐色结品紫的检测限均为05呢/g: 3高效液相色谢法 3.1原理 试样中的残留物用乙睛-乙酸盐缓冲漫合液提取，乙睛再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓第， 经酸性氧化柱净化后。高效液相色谱-0柱后行生测定，外标法定量， 3.2试剂和材料 除另有规定外，试剂均为分析范。水为重蒸帽水。 3.2.1乙睛：液相色谱纯。 3.2.2二氯甲烷， 32.3甲醇：液相色谐纯。 3.2.4乙酸盐缓冲液：溶解4.952无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950L水中，用冰乙酸博节溶液 H到4.5，最后用水稀释到儿。 3.2.520%盐酸及胺溶液。 3.2.61.0o1/L对-甲苯碳酸：称取17.2g对-甲苯确酸，并用水稀释至100l.. 3.2.750Do1/L乙酸装缓冲溶液：称取385g无水乙酸拔溶解于1000L水中，冰乙酸调到L.5. 3.2.8二甘醇。 3.2.9酸性氧化铝：80-120目. 3.2.10二氧化铅. 3.2.11硅藻土5451色清层析级。 3.2.12标准品：孔衡右绿(G)、隐色孔蛋石绿（山%），结品繁(CV)·隐色结品紫(1CV),纯度 大于981. 32.13标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔霍石绿，结品鳜、隐色结晶紫，用乙睛分别配剖 成100/L的标准贮备液，再用乙精稀释配制1/L的标准溶液。-18℃避光保存。 3.2.14混合标准工作溶液：用乙精稀释标准溶液(3.213)，配制成每毫升含孔霍石禄，隐色孔蜜石 绿、结福紫、隐色结备紫均为20g的湿合标准溶液。-18℃避光保存。 3.3仪器和设餐 3,3.1高效液相色谱仅：配有紫外一可见光检测器： 3.3.2匀浆机. 3.3.3离心机：4000r/ain. 334固相萃取装置. 3.3.525%0氧化柱：不锈钢预柱管(5c×▣i.山，两端附2过滤板，抽真空下，填装含有25%化0 的硅藻土。添加数滴甲醇压实，。能紧。酯用前用甲醇冲洗。并将化0氧化柱连接在紫外-可见光检测器 与液相色游柱之间。 3.3.8酸性氧化铝柱：1g/3✉L,使用前用5=L乙睛活化。 3.4样品制备 3.4.1提取 称取5.00g样品于60L离心管内，加入1.5l.20m的盐酸羟胺溶液、25l.1.031/几的对-甲苯 磺酸溶液、5.0L乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10000r/ai的速度均质30s,加入10L乙精别震 超30s。加入5g酸性氧化铝。再次震荡30s。3000r/an离心10n:把上清液转移至装有10L水 和2止二甘醇的100l离心管中。然后在0L离心管中加入10l乙睛，重复上述操作，合并乙睛层. 4
GB/T19857—2005 4 本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量的之和，以结晶紫表 示。 2.9 方法检测限 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为0.5µg/kg。 3 高效液相色谱法 3.1 原理 试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩， 经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量。 3.2 试剂和材料 除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。 3.2.1 乙腈：液相色谱纯。 3.2.2 二氯甲烷。 3.2.3 甲醇：液相色谱纯。 3.2.4 乙酸盐缓冲液：溶解 4.95g 无水乙酸钠及 0.95g 对-甲苯磺酸于 950mL 水中,用冰乙酸调节溶液 pH 到 4.5, 最后用水稀释到 1L。 3.2.5 20%盐酸羟胺溶液。 3.2.6 1.0 mol/L 对-甲苯磺酸：称取 17.2g 对-甲苯磺酸，并用水稀释至 100mL 。 3.2.7 50 mmol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取 3.85g 无水乙酸铵溶解于 1000mL 水中，冰乙酸调 pH 到 4.5。 3.2.8 二甘醇。 3.2.9 酸性氧化铝：80~120 目。 3.2.10 二氧化铅。 3.2.11 硅藻土 545：色谱层析级。 3.2.12 标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度 大于 98%。 3.2.13 标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制 成 100µg/mL 的标准贮备液，再用乙腈稀释配制 1µg/mL 的标准溶液。-18℃避光保存。 3.2.14 混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石 绿、结晶紫、隐色结晶紫均为 20ng 的混合标准溶液。-18℃避光保存。 3.3 仪器和设备 3.3.1 高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。 3.3.2 匀浆机。 3.3.3 离心机：4 000 r/min。 3.3.4 固相萃取装置。 3.3.5 25% PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm×4mm i.d)，两端附 2μm过滤板，抽真空下，填装含有 25% PbO2 的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前用甲醇冲洗。并将PbO2氧化柱连接在紫外-可见光检测器 与液相色谱柱之间。 3.3.6 酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用 5 mL 乙腈活化。 3.4 样品制备 3.4.1 提取 称取5.00 g样品于50 mL离心管内，加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L的对-甲苯 磺酸溶液、5.0 mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10 000 r/min的速度均质30 s，加入10 mL乙腈剧烈震 摇30 s。加入5g酸性氧化铝，再次震荡30 s。 3 000 r/min离心10 min。把上清液转移至装有10 mL 水 和2 mL 二甘醇的100 mL离心管中。然后在50 mL离心管中加入10 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层
GB/T19857-200S 3.4.2净化 在离心管中如入15L二氢甲烷，最荡10s,3000r/ain离心10min,将二氢甲烷层转移至100L 的梨形瓶中，再用5l乙睛、10山二氧甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100L梨形瓶中。 45℃旋转蒸发至约1L。用2,5L乙睛溶解残渣， 将酸性氧化铝柱(33.6)安装在国相萃取装置上，将梨彩粗中的济液转移到柱上，再用乙睛洗涤国 两次，每次2.5L,把沈涤液傣次通过柱，控制流速不超过0.6/in,收集全部流出液。45℃装转蒸 发至近干，残液准确用0,5L乙睛溶解，过0,45μ■滤履，滤液佛液相色潜测定。 3.5测定 3.5.1液相色讲条件 )色谱柱：C18柱，2504.6m(i.d.)粒度5u■在C18色谱柱和检测卷之间连接25%0 氧化柱： b)流动相：乙肪和乙酸按缓冲溶液(3.2.7)，梯度洗脱参数见表1： e流速：l.0l/ain 山柱温：室温： e)检测波长：618m(孔霍石绿)：588m(结福紫)： 0进样量：0uL ·流动相梯度表 时间(ain) 乙睛，第 乙酸按缓冲溶液，韦 60 40 4 80 20 15 80 20 15.1 95 5 17 95 5 17.1 60 40 20 60 6 3.5.2液相色讲测定 根据样液中被测几崔石绿、隐色孔崔石绿、结品紫域隐色结品紫含量情况，速定峰高相近的标准工 作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结品繁暖隐色结品紫响应值均应在仪器检测 线性范网内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色请条件下，孔而石绿、结品繁，隐 色孔霍石绿和隐色结晶紫的保雷时问约为(.10ain,7,88ain,17.T7min,18.22如in.标准品色请图参见 附录A中图A.2。 3.5.3空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 3.5.4结果计算和表运 按式(2)计算样品中孔蛋石绿、励色孔雀石绿、结品繁和隐色结品繁残图量。计算结果香扣除室 白值
GB/T19857—2005 5 3.4.2 净化 在离心管中加入15 mL 二氯甲烷,振荡10 s， 3 000 r/min离心10 min， 将二氯甲烷层转移至100 mL 的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100 mL梨形瓶中。 45℃旋转蒸发至约1 mL，用2.5 mL乙腈溶解残渣。 将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶 两次，每次2.5 mL, 把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋转蒸 发至近干，残液准确用0.5 mL乙腈溶解，过0.45μm 滤膜，滤液供液相色谱测定。 3.5 测定 3.5.1 液相色谱条件 a) 色谱柱： C18柱，250 mm ×4.6mm（i.d.）， 粒度5μm，在C18色谱柱和检测器之间连接25% PbO2 氧化柱; b) 流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液 (3.2.7),梯度洗脱参数见表1； c) 流速：1.0 mL/min; d) 柱温：室温; e) 检测波长：618 nm(孔雀石绿); 588 nm(结晶紫); f) 进样量：50 μL。 ● 流动相梯度表 时间（min） 乙腈, % 乙酸铵缓冲溶液, % 0 60 40 4 80 20 15 80 20 15.1 95 5 17 95 5 17.1 60 40 20 60 40 3.5.2 液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工 作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测 线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐 色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min、18.22min，标准品色谱图参见 附录A中图A.2。 3.5.3 空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 3.5.4 结果计算和表述 按式（2）计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结果需扣除空 白值
GB/T19857-2005 CxAxV A.x 式中： K一一样品中特测组分残留量，g/八kg: C一传测组分标准工作液的浓度，μL: 本一一样品中特测组分的峰面凯： 4一一待测组分标准工作液的峰面积： 上一一样液最锋定容体积。 手一最终样液所代表的试样量， 3.5.5测定蜻果的表述 本方法孔蛋石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代陶物隐色孔霍石绿残留量的之和，以孔金 石绿表示。 本方法结品餐的残图量测定结果系指结晶紫和它的代离物隐色结晶繁残图量的之和，以结品素表 示。 3.8方法检测限 本方法孔霍石绿，隐色孔霍石禄，结晶紫、②色结晶餐的检测限均为2g八g:
GB/T19857—2005 6 C×A×V X= …… (2) As×W 式中： X---- 样品中待测组分残留量， mg/kg； C---- 待测组分标准工作液的浓度,μg/mL； A---- 样品中待测组分的峰面积； As---- 待测组分标准工作液的峰面积； V---- 样液最终定容体积， mL； W---- 最终样液所代表的试样量, g。 3.5.5 测定结果的表述 本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量的之和，以孔雀 石绿表示。 本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量的之和，以结晶紫表 示。 3.6 方法检测限 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.0µg/kg
GB/T19k57-2005 附录A 《资料性附票) 标准离子激图及液相色储图 是他礼凝石择 /生/6 隐是情品期 100 474/门5s 1 孔性石爆 =/123/013 081错等 h3T286 常代隐色孔面石得 /生两T2 常代礼渐石保 /生/2HB 物下物物2成2场前时前粉前菊T房 图A1孔雀石绿，隐色孔雀石绿，结品黛、隐色结晶紫，氢代孔雀石绿和汽代赠色孔雀石绿标准 的离子流图 AU 0.00 5.00 10.00 15.00 t/min 图A2孔雀石绿、隐色孔雀石绿，结品紫，隐色结晶紧标准的凌相色清图
GB/T19857—2005 7 附 录 A （资料性附录） 标准离子流图及液相色谱图 图 A.1 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿标准 的离子流图 图 A.2 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫标准的液相色谱图